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微生物多樣性分析范文1
一、變性梯度凝膠電泳（DGGE）和溫度梯度凝膠電泳（TGGE ）
1993年Muyzer等將DGGE技術引入環境微生物學多樣性的研究。隨后該技術被廣泛用于比較不同生態系統中的微生物群落的多樣性及監測特定微生物種群的動態變化，DGGE和TGGE的原理是根據含有不同序列的DN段（16S rRNA基因擴增產物）在具有變性劑梯度或溫度梯度的凝膠上由于其解鏈行為的不同而導致遷移率的不同，部分解鏈的DN段在凝膠中的遷移速率低于完全螺旋形式的DNA分子，從而含有不同堿基序列的DN段就得到有效分離。結合PCR擴增標記基因或其轉錄物（rRNA和mRNA）的DGGE方法能直接顯示微生物群落中優勢組成成分。由于它可同時對多個樣品進行分析，使之非常適合研究微生物群落的時空變化，而且可以通過對酶切條帶進行序列分析，或通過與獨特的探針雜交鑒定群落組成，可以方便地了解環境擾后的微生物群落變化或某種指示微生物的命運。Oliver等用DGGE方法考察了農田微生物的變化情況，認為環境變化對農田微生物的多樣性有很大影響。但是DGGE/TGGE技術也存在一定的局限性。
其缺陷之一是只能分離約500 bp大小的DN段，這限制了作為下一步用于雜交分析的探針設計。并且研究報道有些種類細菌16S rDNA在DGGE上不只顯示1條帶，而不同種細菌的16S rDNA序列在DGGE上也可能因為具有相同的解鏈行為而不能被分開。即便存在以上的一些局限性，DGGE/TGGE仍是分析微生物群落多樣性較為敏感的方法之一。
二、單鏈構象多態性（SSCP）
SSCP是對16S rRNA基因擴增產物進行分析的另一種簡便有效的方法。該技術最初用來檢測人類DNA的基因多態性，Lee等在1996年首次報道將SSCP技術應用到環境樣品微生物群體多樣性分析。不同堿基序列的單鏈DNA分子構象不同，DN段變性成單鏈后受到凝膠不同分子篩作用力最終使不同DN段得到分離。電泳結束后可以將不同的條帶切下并測序，或采用特異性探針進行雜交，進而顯示該特定微生物類群的動態變化。Holly等利用SSCP技術研究發現在植物根際土壤中大量存在古菌Crenarchaeot，該類微生物以往一直被認為只存在于極端嗜熱環境當中。但是SSCP技術重現性較差，易受膠濃度和電泳溫度等條件的影響。另外，SSCP能夠有效分離的DNA序列過短，為150-400 bp。
三、隨機引物擴增多態性DNA（RAPD ）
由Williams建立的RAPD技術，因具有操作簡便、快速和經濟等優點而得到了廣泛應用。該技術以隨機寡核苷酸（5-10 nt）作為引物，擴增得到的多態性片段較短，更方便檢測兩個同源或異源等位基因的有無，適用于種內和亞種更為細致的分類。張巒等在室內培養條件下，采用RAPD分子標記技術研究了重金屬鎘和多環芳烴菲復合污染對土壤中微生物群落DNA序列多樣性的影響。結果表明，培養15 d和30 d后，鎘-菲單一和復合污染均導致土壤微生物群落DNA序列的豐度、均度和多樣性指數增加。重復性不好是該技術存在的主要問題，而DNA模板的質量與數量、MgCl2和引物濃度的變化都有可能導致得到不同的圖譜。另外，從條帶圖譜中無法得到任何微生物系統發育信息。
四、限制性片段長度多態性（RFLP ） 和擴增核糖體DNA
限制性分析RFLP方法和ARDRA方法也常用于微生物群落的分析。通常用引物PCR擴增得到16S rDN段，被限制酶切割，然后再進行電泳形成不同長度的片斷進行分析。其所獲得的譜帶更為簡單，易于分析，不受菌株是否純培養的限制，不受宿主的干擾，具有特異性強，效率高的特點。廣泛應用于新物種的發現、微生物分類及鑒定、共生菌、病原菌的微生物遺傳多樣性的檢測等。后來有人利用ARDRA方法考察兩種不同農田土壤的微生物群落時，發現兩者無顯著差異。張于光等利用RFLP方法對三江源地區不同的植物類型的土壤中固氮微生物群組成進行了研究，發現所有土壤樣品中分別具有1-2個優勢微生物種群。但是該技術所能獲得的信息量相對較少，并且難以用來評估物種的豐度和均度。
微生物多樣性分析范文2
（貴陽職業技術學院，貴陽 550081）
摘要：采用T-RFLP法實驗研究貴州省特有藥用植物根際叢枝菌根真菌（arbuscular mycorrhizal fungi，AMF）的多樣性。結果表明： 4種貴州省特有藥用植物根際AMF種類豐富，數量較大。植物種類不同，對應的AMF群落多樣性有較大差異，證明了宿主植物對根際微生物群落結構多樣性的影響；同時，有機質、pH和速效磷對根際AMF群落多樣性影響較大。
關鍵詞 ：叢枝菌根真菌；貴州特有藥用植物；群落多樣性
中圖分類號：S567 文獻標識碼：A 文章編號：1006-4311（2015）17-0219-02
作者簡介：封曄（1981-），女，陜西綏德人，貴陽職業技術學院講師，研究方向為微生物應用。
0 引言
貴州特有藥用植物是指目前在貴州省境內發現有分布并具有藥用價值，但是在貴州以外的其它地區都沒有分布的物種，其代表種類有：銀背葉黨參、梵凈山小檗、梵凈山蒲兒根、梵凈山冠唇花、梵凈山火絨草、梵凈山紫苑、短莖羊藿等[1]。
菌根真菌（Mycorrhizal fungi）在自然界中有著重要的生態作用，它可以與世界上大多數的維管植物根系形成互惠共生體。叢枝菌根真菌（Arbuscular mycorrhizal fungi，AMF）是菌根中分布最廣泛的一類。研究表明，AMF因其能擴大植物根系吸收面積、加快養分運輸速率、分泌活化物質、提高光合速率等直接和間接作用，改善宿主植物的礦質營養，增加植物中的碳積累，進而促進植物生長[2]。
目前對藥用植物AMF的研究主要集中在菌根多樣性或接種菌根真菌對植物的影響。李品明等對重慶市13種中藥材植物的AMF物種多樣性進行了研究，結果表明，從中藥材植物根際土壤中分離出了10種菌根真菌，隸屬三個科[3]。王森等以山西歷山自然保護區暴馬丁香、連香樹、南方紅豆杉和領春木4種珍稀藥用植物為材料，從4種植物根際共鑒定AMF 27種[4]。在國內因藥用植物種質資源豐富，宿主范圍十分廣泛，目前已經對上百種藥用植物進行了研究。
長久以來，中藥材大多來自野生藥用植物，但隨著對藥用植物需求的不斷增加，野生藥用植物已經無法滿足人們對藥用植物的需求，甚至瀕臨滅絕，加之人工栽培技術落后、栽培措施不配套等原因，導致藥用植物種質退化、質量下降、入藥性質不穩定等。本課題主要是通過對貴州特有藥用植物根際土壤采集和分析，研究藥用植物根際AMF種質資源及多樣性，以期為充分發掘和利用AMF資源，篩選AMF優勢菌，利用菌根生物技術提高藥用植物產量、品質和擴大人工栽培區提供材料和依據。
1 材料與方法
1.1 研究地概況
采樣地位于貴州東南部茂蘭保護區及織金縣牛場鎮。本區處于溫暖濕潤的中亞熱帶氣候區，區域內有雷公山和月亮山，分布著適宜常綠櫟林及熱帶常綠闊葉林生長的紅壤和紅黃壤，海拔最高處為2178．8m，最低處137m。區域內有中草藥資源十分豐富。
1.2 樣品采集
2014年10月在貴州省茂蘭保護區及織金縣牛場鎮采集鐵皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo）、黃連（Coptis chinensis Franch.）、太子參（Pseudostellaria heterophylla(Miq.) Pax）、丹參（Salvia miltiorrhiza Bge.）根系及根際土。每株按東西南北4個方位，除去5cm厚的表層土后，挖10～20cm深的土壤剖面，剪取帶有細根的根系，用塑膠袋存放根系和根際土樣品。經檢測，土樣基本性質如表1所示。
1.3 AMF的形態觀察及其侵染能力的檢測
采用Philips和Haymay染色方法進行觀察和計算。
1.4 分子生物學方法分析樣品多樣性
1.4.1 總DNA的提取和純化
采用Zhou 等[5]的酶裂解法提取土壤總DNA。
1.4.2 PCR擴增
采用由大連寶生物公司合成的引物AM1 和NS31擴增18SrDNA施測。反應體系為20ml.PCR擴增產物用1.0 %瓊脂糖凝膠電泳檢驗。
1.4.3 群落多樣性分析
采用T-RFLP方法分析樣品，以圖譜中每一個限制性片段（T-RF） 為一個OTU，測定OTU數目即為物種豐富度指數（S），峰高值低于100熒光單位的峰不計入分析范疇。根據豐富度指數（S）和相對峰高值（Pi）測定均勻度指數（E） 和Shannon多樣性指數（H）。
相對峰高值（Pi） ：Pi= ni/ N
均勻度指數（E）：E＝H/lnS
Shannon指數（H）：H＝－∑PilnPi
式中，N為該樣品所有累計峰高，ni為第i個T-RF峰值。
1.5 數據分析
用表3中的實驗數據代入EXCEL（2003）、spss（V17.0）軟件系統進行匯總和分析。
2 結果與分析
2.1 根際AMF的形態及其侵染率
從表2中可見，不同宿主植物根系菌根真菌侵染率不同，四種植物中鐵皮石斛的菌根侵染率最高，丹參最低。對比采樣環境可以看出，侵染率與土壤性質有一定相關性。其中pH越高侵染率越高；侵染率與速效磷和速效鉀呈反比。
2.2 群落多樣性
2.2.1 樣品總DNA提取和基因的擴增結果
從土壤中提取出的總DNA粗提樣品中有大量黑褐色雜質，基因組片段大小為20 kb，用1%瓊脂糖電泳檢測，條帶明亮齊整，這說明所得到的微生物總DNA比較完整。擴增的18 SrDNA基因片段長度為550 bp。
2.2.2 群落多樣性指數
表3可見，4個樣品的根際AMF多樣性存在明顯的差異。其中，豐富度指數和Shannon指數最高的是黃連，最低的是太子參，表明植物種類的差異對根際AMF群落多樣性有影響。
3 結論和討論
根際微生物活性及群落結構的變化是評價土壤生態系統的重要指示因子，通過觀察其變化能夠發現植物和土壤質量[6]。本研究表明，4種貴州省特有藥用植物根際AMF種類豐富，數量較大。由于植物種類的不同，AMF群落多樣性也存在很大的差異。由此可見，宿主植物也會影響根際微生物群落結構多樣性。但Oehl具有不同意見，他認為土壤類型和土地利用模式決定了AMF的群落結構[8]。
對于根際微生物來說，很多的環境因子都對其群落多樣性影響很大，如有機質、pH和速效磷等，這是因為土壤微生物中的養分越高，營養物質就越多，這有利于其活性的增加。卜洪震等發現使用肥料后可以促進土壤微生物的活性，并且不同施肥處理對土壤微生物量碳和微生物多樣性有著重要影響[7]。本研究中速效磷是影響AMF群落多樣性的一個主要因素。而從O’Donnell 等[8]學者的研究成果來看，土壤pH值也是一個重要的土壤微生物群落多樣性影響因子。徐輝[9]在現有研究成果的基礎上展開進一步研究，發現速效磷也直接影響刺槐和沙棘根際AMF侵染率。在自然環境中隨著環境因子的變化，土壤微生物群落的形成和變化也會隨之調整，這說明土壤微生物的生長和環境因子有著直接關系。通過研究土壤微生物群落動態變化，也就為了解生態系統的土壤健康狀況和植被發育階段提供了可能。
參考文獻：
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微生物多樣性分析范文3
關鍵詞:宏基因組;不可培養微生物;篩選系統
中圖分類號:Q75 文獻標識碼:A 文章編號:1674-0432(2010)-06-0044-3
0 引言
Woese和Pace基于16S rRNA或DNA基因序列分析的先鋒研究工作給微生物生態學領域帶來了革命性的變化。在此之前,人們完全沒有意識到真實存在于自然界和在實驗室能培養的微生物數量之間重大的差別。伴隨著克隆和測序技術的發展,細菌通用引物對環境中生物群落總DNA的直接PCR擴增,產生了大量的數據并重新定義了原核生物的多樣性。近年來一些學者對微生態學和宏基因組進行了研究。以下是近幾年報道的關于不可培養的大多數微生物的新的見解和技術。
1 宏基因組的研究
1.1 DNA的分離
環境樣品DNA的質量直接關系到宏基因組分析的質量。Tiedjie等發展了從不同類型的土壤中直接分離DNA 的方法,但是這些方法仍然不能確定在所有的具有代表性的高度復雜的生物群落中能夠獲取全部的總DNA。盡管Coutois等人發現,從土壤中直接提取DNA和先從土壤分離細胞再從中提取DNA所得到的細菌多樣性范圍并無重大差別,但是Luna等人證實,在檢測海水沉淀物時,只用單一的DNA提取方法嚴重低估了細菌多樣性。不同的方法適用不同的環境。比如,Fortin等人發現,在細胞裂解前沖洗被碳氫化合物和重金屬嚴重污染的土壤和海水沉淀能改善DNA的質量。
選擇一種DNA提取方法用于宏基因組分析需要分析樣品的信息。在預測一個生態環境中不同的微生物群落成員的潛在功能的時候,分辨DNA來自樣品來自可培養的微生物還是來自死細胞是很有價值的。Nocker和Camper表明,用ethidium monoazide(EMA)的衍生物分析成熟的生物膜16S rRNA基因指紋圖譜,提取處理過的樣品和未經處理的樣品的DNA有重大的區別。對環境中的活體,很有必要區分DNA來自胞內還是胞外。水沉淀中包含了大量來自胞外的DNA,Corinaldesi等人改進了一種允許同時提取胞內和胞外DNA的方法,這些DNA可能對細菌的新陳代謝起著重要的作用。
1.2 系統發生和宏基因組的分析
DNA提取方法的改進、測序手段的進步和測序成本的降低使我們能夠解決以下問題:在一個群落中不連續的單元里共生多少種類的細菌以及環境中是什么因素影響著群落的組成和多樣性。Acinas等運用不同的PCR擴增方案建立了兩個獨立的沿海浮游生物的16S rRNA文庫。這兩個文庫的比較表明了PCR擴增可能會高估文庫中獨特的rRNA序列。盡管如此,PCR的誤差仍然不能說明樣品中的所有16S rRNA基因的微小差異(1%的序列差異)。97種已完全測序細菌全基因組比較表明,它們包含242種屬于非同源多操縱子的不同16S rRNA基因。序列分析還表明任何基因組中的16S rRNA內部操縱子的差異在1%以內。引入一個修正參數2.5(242個rRNA操縱子和97個基因組相除)到浮游生物樣品待測序的序列中,以99%的相似性(1113)為標準,Acinas等預測這些樣品中至少包含了446種緊密相關的基因組。因此這些數據間接的表明了這個種群內部包含有大量相似的種類。基因序列也開始用于推斷一個群落中各個體的角色和功能,這比僅確定群落中的種類更有意義和更具挑戰。
在低度多樣性環境中,普通的測序就能得到環境中的微生物信息。比如在一個種群細菌復雜程度不高的酸性礦井排水裝置中的生物膜中,可以對單個菌株的代謝途徑進行分析。在Tyson等人的研究中,細菌種群只由五種主要的種類組成,而且其中兩種幾乎存在所有的覆蓋面積內。而許多自然環境中種群結構高度復雜,不能采用現在的方法。據估計在一份農場土壤樣品中有超過5000種,104-105株的細菌。要得到這些復雜環境中占有最優勢地位的細菌種類的八倍的覆蓋量,必須產生二十億到五十億個堿基對的序列。為了避免對全基因組集合,Tringe等大量使用未集合的序列來讀取一定時期內環境中標記基因。基因定量包括對特定生態環境能反映已知環境特點的環境樣品的分析。以基因比較為中心對特定環境中基因定位給我們更好地認識和解釋環境帶來了新的機遇,也提出了新的問題。
處理復雜環境的另一條途徑是將許多種類混合的16S rRNA基因克隆到單一的載體里面。其中,SARST(serial analysis of ribosomal sequence tags)發現了V1或V6高變區。這些位于核糖體小亞基rRNA上的高變區(叫做V1或V6區)長度大約為17-55bp,這些復雜的生物體中的片斷可以連接到單個的克隆里面去。用這種方法,單個測序反映能達到的序列標記可達20個。這種方法可以鑒定菌群可達到屬的水平。van der Lelie等人報道了一種改變的序列標記方法,用于基因組中短的保守序列,結合限制性內切酶消化產生標記,可以區分親緣關系很近的菌株。一些細菌的保守基因已經鑒定出來,包括rpoC,uvrB, recA 和16S rRNA 基因。在這些基因中,16S rRNA是差別最大而且可以應用于所有的原核生物種類分析的基因,可以達到屬的水平,很大一部分還可以分辯到種的水平。
近年來,以16S rRNA基因為基礎的微生物分類陣列已經成為鑒定微生物區系的最有力的方法。這種微生物分類陣列由大量不同門類的細菌的標記探針組成。不同原型的陣列已經發展并開始用于估計環境種群中微生物的多樣性。這種以16S rRNA基因為基礎的微生物分類陣列將成為監測各種復雜環境中微生物多樣性的一個最重要的工具。
復雜環境中微生物區系指紋圖譜和宏基因組分析將來可能發展為基因芯片。一個完全的綜合芯片到目前為止仍然是一個對未來的展望。Hong等人描述了一種基因芯片的概念,這種芯片通過分離不同種類和數量的細菌或哺乳動物的細胞并裂解提純DNA或者mRNA來實現。基因芯片的研究對我們認識和監測一定的微生態環境中微生物種群結構的認有著非常重要的意義。
直到今天,宏基因組的研究還只在生物量相對較高的環境中進行。在對細胞、量很少的環境進行宏基因組的分析還需要一種新的文庫構建方法。Abulencia等描述了一種多態性擴增嚴重污染的土壤中有機體基因組的方法。從嚴重污染和細胞密度極低的地表下土壤樣品中提取DNA,￠29DNA聚合酶用于擴增總基因組。通過第一次基因組DNA的擴增,污染的土壤中細菌多樣性分析,和細菌基因組文庫構建是可能的。盡管存在擴增的偏好現象,在一個微小的細菌樣品中擴增宏基因組DNA,仍然可以得到一些以前無法得到的基因組的信息。
1.3 篩選宏基因組表達文庫
另外一種方法是通過構建和篩選宏基因組表達文庫,或者通過測序和限制性內切酶的方法來篩選。直接篩選宏基因組文庫的一種局限就是需要超高通量的篩選系統,或者大量的可用的篩選的陣列。可以通過富集基因的方法來篩選由數百萬個基因組成的宏基因組文庫中的稀有基因。其中一種富集的方法是底物誘導表達篩選(substrate-induced gene expression screen,SIGEX)。Uchiyama等完善了一種高通量的SIGEX篩選方法,他們將目的基因和綠色熒光蛋白(GFP)連接起來,轉到表達載體內,通過檢測激發的熒光來檢測相應的克隆。宏基因組DNA被克隆到gfp基因序列的上游后,通過FACS方法來排除所構建文庫中組成型表達gfp的克隆。再將未表達gfp的克隆轉移到含有靶標底物的培養基中,通過誘導gfp基因表達來篩選克隆子。這種篩選體系的機理是:分解代謝相關的基因能夠在特定代謝物的作用下被誘導表達。
1.4 通過培養方法獲取不可被培養的大多數微生物
要大量精確測序復雜環境中的微生物DNA樣品,不是一件很容易的事情,這也說明了全面的獲取微生物信息的方法的重要性,可以通過這些信息來理解微生物間及微生物與環境間的相互作用。盡管“環境基因組”能夠提供大量的信息,但對生理學,生態學和進化學有重要影響的分類單元中可培養微生物單菌落的會給生態小環境的研究帶來深遠影響。Proteorhodpsin的發現及它的編碼基因存在于Pelagibacter ubique證明了獲取可培養單菌落的作用。Proteorhodpsin編碼基因是在海水和環境微生物宏基因組的克隆測序過程工程中第一次被發現的,但是我們不能確定不可培養的微生物基因組中包含Proteorhodpsin基因。通過培養Pelagibacter ubique,我們就有可能將Proteorhodpsin與固定的種類聯系起來。
許多研究者們正在努力研究與模擬專一的可培養的微生物,并且利用將這些微生物來研究它們環境中所處的地位和發揮的作用。基因組測序已經為我們提供了大量的信息并了解這些微生物在環境中的作用。
經典的微生物培養策略都是一貫地給微生物系統提供過量的營養,從而導致能形成菌落或薄膜的和快速生長的細菌富集。對于依賴稀釋培養基或模擬自然環境培養基才能生長的細菌,Ferrari等人描述了一種模擬自然環境條件的用于培養土壤微生物的新穎方法。他們研究組所采用的泥漿膜系統中,一種聚碳酸酯是作為生長培養支持物,土壤提取物作為培養基。研究結果是長出了大量的未被鑒定的微型菌落。Koepke等人將多種不同的培養方法應用到沿海地表下的沉積物,研究發現多數情況下沒有一組微生物能夠在幾種培養方法中都被培養出來。他們的研究肯定了這個觀點:沒有一種單一的培養方法或者培養基適用于分離專一樣本中的多種多樣的微生物。同時采用低營養條件富集和分子方法,在冰島富含中性硫化物的熱溫泉中得到了具有一種高度差異型的淀粉酶基因。使用熱溫泉水的微生物富集方法采用低濃度淀粉和長時間溫育,最后選育出能夠降解淀粉但生長緩慢的微生物。
在培養之前,將樣品中的多種特定的微生物選擇性地分離出來可以降低微生物群落的復雜性。Miteva和Brenchley的過濾培養,結合長時間溫育,使一些新穎而極小的細胞菌落得到富集。這種方法對于研究極端條件下的微生物的代謝特性及長時間存活機制是很有益的。
2 結語
要得到不可培養的大多數微生物的信息,還有很漫長的路要走。在不久的將來,使用更便宜更快捷的測序方法,環境工程測序技術將會產生更加多樣的數據和信息。然而,測序并非我們認識環境微生物的唯一方法。我們需要一種新技術,它能夠針對直接分析和估量環境和培養條件下的微生物細胞,并且盡可能地和自然界真實的狀況接近。對于單個微生物細胞進行完全的特征分析也是一項很有意義的工作。雖然在當今的條件下還沒能實現,但是關于單細胞微生物學已是一個很明顯的趨勢,能讓我們解決更多懸而未決未的環境微生物的問題。總之,在工程學,生物地球化學,生物化學,生物信息學,生理學和生態學等多種學科快速發展的基礎上,宏基因組學的研究將會使我們進一步加強對于環境對微生物多樣性分析的理解和對微生物環境功能的認識。
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微生物多樣性分析范文4
1材料與方法
1.1供試材料
1.1.1供試土壤
供試土壤采自西北農林科技大學試驗田,土壤塿類型為土,土壤肥力中等,其主要理化性質為:pH8.32,有機質13.20g•kg1,全氮、全磷、全鉀含量分別為0.79g•kg1、0.61g•kg1和11.14g•kg1,堿解氮、速效磷、速效鉀含量分別為61.03mg•kg1、16.67mg•kg1和154.40mg•kg1。土樣風干、混合均勻后過篩備用。
1.1.2供試肥料
供試肥料包括尿素、磷酸二氫銨、硫酸鉀、有機無機復混肥、生物復混肥。有機肥為將豬糞、小麥秸稈等調節到合適的C/N、pH和含水量后經高溫堆制發酵腐熟制作而成,其主要養分含量為N18.6g•kg1、P2O59.0g•kg1、K2O12.2g•kg1。生物復混肥是在有機肥的基礎上加入少量的無機肥,無機肥配比為N4%、P2O52%、K2O3%[10],然后將液體芽孢桿菌復合菌劑(固氮菌Azotobacterchroococcum、解磷菌Bacillusmegaterium、解鉀菌Bacillusmucilaginous由西北農林科技大學資源環境學院微生物實驗室提供,已鑒定各菌株間無拮抗)與蛭石按1∶2混合吸附,均勻摻入上述有機無機復混肥中。有機無機復混肥是添加等量滅菌的蛭石,其中的有機肥、無機肥及其配比均與生物復混肥完全相同。肥料均為自制,配制完成后保存1個月再施用。生物復混肥和有機無機復混肥中氮磷鉀含量均為N55.5g•kg1,P2O518.7g•kg1,K2O36.9g•kg1,有機質360.8g•kg1,功能芽孢桿菌總量為0.21×108cfu•g1。
1.1.3供試作物
供試作物為“鄭單518”玉米,由西北農林科技大學種子公司提供。
1.2試驗設計
試驗采用盆栽的方式,于2011年6月在西北農林科技大學資源環境學院玻璃網室中進行。試驗設置對照(CK,不施肥)、無機肥(T1)、有機無機復混肥(T2)、生物復混肥(T3)4個處理,4次重復。生物復混肥按0.20g(N)•kg1(土)施入,其他肥料均按生物復混肥中氮磷鉀的量等量施用。將肥料與12.5kg土樣充分混勻后裝盆,澆透水至土壤含水量為田間最大持水量的60%。玉米催芽后直接播種,出齊苗后間苗,每盆保留3棵,并于定苗1d、15d、30d、45d、60d時采集土壤樣品,在各個處理4次重復內隨機取0~20cm的土壤各100g并置于4℃冰箱,用于分析土壤微生物學特性;取玉米生長60d時的土樣在48h內進行土壤微生物群落功能多樣性分析。試驗設置保護行,試驗期間根據實際情況定量澆水,并經常更換盆的位置,不同處理的盆栽管理措施均一致。
1.3測定項目和方法
土壤微生物群落功能多樣性分析采用BIOLOGECO測試板進行測定[11]。土壤微生物量碳、氮、磷用氯仿熏蒸提取法測定[1112],采用重鉻酸鉀外加熱法測定提取液中的可溶性碳,采用過硫酸鉀氧化法測定提取液中的總氮,采用NaHCO3浸提鉬銻抗比色法測定提取液中的總磷,土壤微生物量碳、氮、磷的換算系數分別為0.38、0.54、0.40。
1.4數據處理
采用微平板培養96h的數據進行數據統計分析,采用AWCD、Shannon指數和豐富度指數來表征土壤微生物群落代謝功能多樣性[8,13]。數據經Excel2003處理后,采用SPSS16.0軟件進行方差分析和主成分分析,主成分分析采用協方差矩陣為因子提取依據,其他參數選取系統默認值。
2結果與分析
2.1生物復混肥對土壤微生物群落功能多樣性的影響
2.1.1土壤微生物群落多樣性指數分析
土壤微生物群落功能多樣性是土壤微生物群落狀態與功能的指標,反映了土壤微生物的生態特征。表1為玉米生長60d時各施肥處理的土壤微生物群落功能多樣性指數,從表1可以看出,BIOLOG微平板培養96h時,T3處理AWCD與其他處理間差異顯著;微生物群落Shannon指數大小順序為T3>T1>T2>CK,T3處理與其他處理間差異顯著;T3處理土壤微生物群落的豐富度指數高于其他處理。以上結果表明,生物復混肥處理(T3)可以提高土壤微生物群落的功能多樣性和種群豐富度,有利于提高土壤生態系統的穩定性。
2.1.2土壤微生物對6類碳源的利用
土壤微生物對不同碳源的利用情況反映了土壤微生物的代謝功能類群。從表2可以看出,玉米生長60d時,T1、T2、T3處理土壤微生物群落利用碳源的顯著類型為糖類、羧酸類和氨基酸類,可能是因為這3類碳源是土壤微生物代謝最基本的物質,能夠被大多數土壤微生物代謝利用。而對于多聚物類、多酚化合物類和多胺類這3類碳源,T3處理與其他處理間差異顯著,表明T3處理的土壤微生物碳代謝群落結構與其他處理有所不同,該處理土壤微生物群落對多酚化合物類的利用明顯高于其他處理,可能是土壤中施入的有機肥在微生物作用下,腐殖化過程中多酚類物質有一定積累,進而激活了能夠利用多酚類物質的微生物的活性,從而提高了土壤微生物對多酚化合物類物質的代謝與利用。土壤中微生物對多酚類物質的利用顯著提高的現象在其他研究中也有出現[14],具體原因還需要進一步研究。
2.1.3土壤微生物群落功能多樣性主成分分析
為清晰地了解不同施肥處理對土壤微生物群落代謝能力的影響,利用培養96h后測定的AWCD數據進行主成分分析(PCA)。從表3可以看出,對PC1(第1主成分)貢獻大的碳源(特征向量≥0.50)有17種,其中糖類占35%,羧酸類占24%,影響PC1的主要碳源為糖類,其次為羧酸類和氨基酸類;對PC2(第2主成分)貢獻最大的碳源糖類占50%,其次為羧酸類(25%),因此,對PC1和PC2起分異作用的主要碳源是糖類和羧酸類。與PC1正相關程度較高的碳源有α-D-乳糖和L-精氨酸,負相關的碳源有D,L-α磷酸甘油和吐溫40,不同施肥處理土壤微生物在碳源的利用上既有共同點又有差異,差異可能是由于不同處理土壤微生物群落有所差異,也可能是因為某些碳源是微生物生理代謝途徑中的重要物質[15]。從不同施肥處理土壤微生物群落功能多樣性的主成分分析可以了解各種處理土壤微生物群落功能的相似狀況,結果如圖1所示,PC1方差貢獻率為27.640%,PC2為19.089%。不同處理土壤微生物群落在碳源的利用能力上存在明顯差異,表現在它們在第1、2主成分上得分系數差異明顯。CK、T1和T2處理的土壤微生物在PC1上的得分值分布一致,與T3處理區分明顯,T3處理土壤微生物在PC1上的得分值均為正值,CK、T1和T2處理土壤微生物在PC1上的得分值基本為負值;T2處理土壤微生物在PC2上的得分值為正值,而CK和T1處理土壤微生物在PC2上的得分值基本上為負值,較難分開。這表明生物復混肥處理的土壤微生物群落代謝結構與其他處理具有明顯差異,而無機肥和CK處理土壤微生物群落功能相似。施用生物復混肥能提高土壤微生物對不同碳源的代謝能力,提高土壤微生物群落功能多樣性,為土壤提供一個良好的生態環境。
2.2生物復混肥對土壤微生物量碳、氮、磷的影響
土壤微生物生物量是土壤有機庫中的活性部分，是存在于土壤微生物體內或殘體細胞中可供利用的養分的貯備庫,是土壤養分轉化的動力和中轉站,與土壤中的C、N、P等養分轉化和循環過程密切相關,反映土壤微生物活動的強弱和養分轉化速率的快慢,從宏觀上反映土壤微生物活性的總體狀況,是土壤生物質量、土壤肥力變化的靈敏指標。研究表明,不同施肥制度對土壤微生物生物量也有顯著影響[1618]。從圖2可以看出,土壤微生物量碳、氮、磷的變化規律大體一致,土壤微生物量在玉米整個生長期中大致呈先升高后逐漸平穩的變化趨勢,與王艷霞等[19]研究結果相似;且土壤微生物量碳、氮、磷的含量均以生物復混肥處理最高,最高值分別為333.21mg•kg1、53.02mg•kg1和22.20mg•kg1。在土壤微生物量碳變化規律中,生物復混肥處理在玉米生長第30d、45d時較高,并且顯著高于其他處理。生物復混肥處理顯著提高土壤微生物量碳的主要原因可能是生物復混肥中所添加的功能性微生物菌群施入到土壤中,能夠使有益微生物在土壤中形成優勢種群,很好地在植物根際成功定殖,發揮其生態功能;另一方面,生物復混肥本身帶入的活性有機碳源促進了土壤微生物的繁殖,提高了土壤微生物活性。各處理土壤微生物量氮含量在定苗前期沒有明顯差異,在玉米生長第30d時顯著升高,生物復混肥處理的微生物量氮含量與其他處理相比差異顯著。反映出玉米快速生長期時由于根際活動等促進土壤微生物大量繁殖,生物復混肥處理提高了土壤微生物活性,氮素固定同化到微生物體內引起土壤微生物量氮含量升高。土壤微生物量磷的變化規律與土壤微生物量碳、氮不同,玉米生長前期各處理間差異不明顯,在玉米生長第15d后生物復混肥處理的土壤微生物量磷顯著升高,說明玉米快速生長期間,土壤微生物對土壤中有機態和無機態磷的同化作用加大,以微生物量磷的形式存在,土壤中微生物解磷與固磷作用也與土壤中可降解有機物的數量有關,有機或無機肥料中的磷素對土壤微生物量磷的增加有明顯的貢獻作用[2022]。本試驗土壤微生物量磷的升高趨勢比較穩定,與趙蘭鳳等[23]研究結果相似。
3討論
不同施肥措施會導致土壤微生物功能多樣性的系統變化,形成各自特定的土壤微生物種群,長期施用有機肥可明顯增加土壤微生物種群的變異程度[24]。羅希茜等[25]研究稻田土壤微生物群落發現,施用化肥或配施有機肥可使黃泥土土壤微生物的碳源利用率顯著高于對照,有利于維持土壤微生物的碳源利用能力。Wei等[26]研究長期不同施肥處理對黑土細菌群落結構和功能的影響,結果表明無機肥處理與有機無機復混肥處理土壤微生物在單一碳源利用率方面沒有顯著性差異,但在土壤微生物群落結構組成、功能穩定性上有差異,施用化學肥料會降低土壤微生物群落的穩定性,本研究結果與上述研究結果類似。徐華勤等[27]對茶園土壤微生物群落功能多樣性的主成分分析表明,糖類和羧酸類物質是區分各處理的主要碳源。本研究主成分分析結果也表明,不同施肥處理土壤微生物功能多樣性差異明顯,起分異作用的主要碳源是糖類和羧酸類。Garland等[28]研究表明,樣本在主成分軸上的分布與微生物對碳源底物的利用能力有關,PC1解釋了大部分的變異,生物復混肥處理分布在PC1的正方向,結合生物復混肥處理對6類碳源的利用,進一步證實生物復混肥處理可提高土壤微生物的代謝能力。土壤微生物功能多樣性變化不僅受施肥影響,還與土壤養分密切相關,但是這方面的研究還較少。孔維棟等[29]和區余瑞等[30]的研究表明,土壤有機質和全氮含量與土壤微生物功能多樣性呈正相關。因此,為了全面表征土壤肥力的微生物指標體系,本研究將從土壤微生物多樣性與養分的關系方面進一步探討生物復混肥的施用效果。土壤微生物量能夠快速反映土壤養分含量變化及植物根際活動帶來的土壤微生物活性的變化。Masto等[17]認為微生物熵更能夠反映出土壤微生物活性和土壤有機碳的動態變化。土壤微生物群落結構的變化可能是導致土壤微生物量變化的首要原因[31]。在本研究中,生物復混肥處理能夠提高土壤微生物群落功能多樣性,其土壤微生物群落結構也比較穩定,因此,在玉米快速生長期間生物復混肥處理的土壤微生物量顯著高于其他處理,具有較大的N、P、K中轉代謝庫,能夠為植株提供更多的有效養分。
微生物多樣性分析范文5
【關鍵詞】 環境污染 監測 基因
隨著經濟與人口的快速發展，環境污染導致生態系統功能退化，以致引起生物多樣性降低，物種的分布與群落組成發生了巨大的變化。與此同時，分子水平上研究污染過程中污染物在生物體內的吸收與遷移不斷受到人們的關注。PCR技術具有快速、靈敏、簡便等優點，在環境監測領域方面的應用日趨顯現。
1 PCR技術
聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction；PCR）是一種用于放大擴增特定的DN段的分子生物學技術，它可看作是生物體外的特殊DNA復制，PCR的最大特點，是能將微量的DNA大幅增加。目前PCR技術在微生物學、醫學等方面已得到較好的應用[1]。這種技術具有簡便、快速、靈敏的特點，已廣泛應用于基因獲取、基因定點突變、DNA序列分析、醫學診斷、基因檢測等方面。PCR技術也成為微生物領域重要的監測手段，在此基礎上發展起來的Real-time PCR（實時熒光定量PCR技術），以Power SYBR Green（熒光標記染料）和熔解曲線為基礎，可用于檢測不同的核苷酸序列；相對于普通PCR，熒光定量PCR（RT-PCR）能對樣品中的目標生物進行相對或絕對定量，且靈敏度高，可重復性強，便于實驗結果的比較等諸多勢。
近年來，實時定量PCR技術開始在環境領域中顯示巨大生機。迅猛發展的PCR技術使生物監測深入到分子水平，形成了一系列可依據多種分子技術來進行生物監測的分子學方法。如熒光定量PCR可以用來檢測環境中的微生物在河流中隨季節的變化情況。熒光定量PCR還可以用來檢測地表水和飲用水中致病菌的含量。對于微生物，特別能快速監測具有高效去除營養物質能力的微生物，熒光定量PCR能快速監測[2]。如利用PCR技術能定量污水處理廠一級硝化處理后混合液懸浮固體中總細菌、硝化螺菌屬數量、氨氧化細菌數量，從而可以實時掌握污水處理情況。法國國家研究中心從活動熱泉附近的一個沉積物核中提取DNA來研究原生動物物種進化關系，利用測得的DNA序列數據構建系統進化樹時，發現沉積物中至少含有兩種遺傳組成上與已知原生生物差異極大的細菌，發現了許多新原生生物世系。這些發現為水生生物基因學分類開創了先河，也將推動基因學在更廣泛的領域得到應用。2003年初，Hebert等[3]首次提出了DNA條形碼的概念。DNA條形碼技術（DNA barcoding）是通過對一個標準目的基因的DNA序列進行分析從而進行物種鑒定的技術，用DNA序列作為標記來與物種信息建立一一對應關系。DNA條形碼是指利用短的標準DNA序列的核苷酸多樣性進行物種的鑒定和快速識別。
2 在水生生物監測領域的應用
目前水生生物監測主要包括水體中微生物、浮游動物、底棲動物等類群的監測，通過野外觀測水體中指示物種、群落結構組成和多樣性，了解和掌握實際水體中環境污染的狀況。全世界每年有2億5千萬人感染水源性疾病，因此而死亡的人數為1千萬-2千萬。這要求對水體中致病菌進行準確檢測，以保證后續工作的正常開展。研究者[4]發現PCR技術對星狀病毒的檢測比電鏡技術更為靈敏，并可鑒定這一病毒的不同血清型。
隨著高通量測序技術的發展，以及人們對PCR技術的研究的深入，PCR技術能夠從單個環境樣品中獲取DNA。在水生生物監測方面，當前國際上美國EPA，加拿大環保署以及歐洲的一些科研單位正在開展PCR技術在水生生態監測中的應用研究；在我國，水生生物監測仍使用傳統的形態學鏡檢，目前僅有少數研究利用分子生物學技術[5-6]，更沒有形成一定的體系，以前行業規范。
3 PCR技術用于水生生物監測的優缺點
相對于之前的監測方法，PCR技術具有四大優勢：（1）操作過程快速簡便，非專業分類學者也可利用PCR數據庫完成鑒定工作，（2）易于構建統一鑒定標準，（3）成本低，（4）易于質量控制。
相對于傳統的監測方法，PCR技術的不足：（1）假陽性問題，當不相關的核酸分子中存在與模板非常相似的堿基序列時，PCR很可能做出假陽性的結果，這要求在引物的設計上要更為嚴格、更為細心。（2）質控問題，由于PCR靈敏度高，要求實驗過程中不能帶入干擾物質，無菌操作環境。（3）前期投入成本高，PCR鑒定水生生物多樣性，需先構建本土物種PCR基因數據庫，這要求投入大量的人力、物力、財力。
盡管如此，相信未來隨著人們研究的不斷深入，技術方法的不斷優化，PCR技術將會給水生生物監測注入新的生命力。
參考文獻：
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微生物多樣性分析范文6
關鍵詞：生物多樣性；多樣性功能評價；濕地保護；衡水湖濕地
Biopersity Function Evaluation of the Hengshui Lake Wetland
ZHANG Xue-zhi
(Hengshui Bureau for Hydrology and Water Resources Survey of HebEi Province，Hengshui 053000，China)
Abstract: The Hengshui Lake wetland，located in the hinterland of North China Plain，is a bio-intensive wetland in the North Temperate Zone，an intersection area for the different migratory birds，and the best habitat in North China Plain for many rare and precious birds.According to the survey data of the wetland biopersity，this study conducted a persity function evaluation on species persities and ecosystem persities in the wetland.According to the wetland biopersity criteria，the Hengshui Lake wetland biopersity is at a general level.Biopersity function evaluation of the wetland we can provide scientific basis for the wetland protection.
Key words: biopersity;persity function evaluation;wetland protection;the Hengshui Lake wetland
1 衡水湖濕地屬性
按照國際濕地公約的濕地分類［1］，衡水湖濕地主要為湖泊濕地、沼澤濕地、水體沼澤化濕地、鹽沼濕地、河流濕地和渠道濕地等。其中湖泊濕地、沼澤濕地是濕地的主體，類型與面積占據主要地位。其他類型濕地居次要地位。此外，還有少量人工濕地如溝渠、養魚池等。各種類型濕地關系十分密切，它們相互依存，共同構成衡水湖濕地生態系統。任一類型濕地的退化都將對衡水湖濕地的生態與環境功能產生巨大的影響［2-4］。
1.1 生物多樣性保護層次
衡水湖具有非常重要的濕地生態服務功能，是北溫帶野生動植物聚集地和候鳥南北遷徙不同路線的交匯處，這里有植物370種，鳥類286種，魚類26種，昆蟲194種，兩棲爬行類17種，哺乳類17種，生物多樣性非常豐富。
保護生物多樣性和生態系統功能的完整性與保護珍稀動植物有著同等重要的意義。許多物種雖然未被列入國內外各種動植物保護名錄，但其或為重點保護珍稀鳥類提供棲息地和繁殖地，或直接（間接）為這些珍稀鳥類提供食物，共同構成適宜的鳥類生境。所以保護這些物種，保護生物多樣性對于珍稀鳥類的保護也是至關重要的。同時，保護生物多樣性也就是保護濕地這一天然物種基因庫，以利于我們子孫后代對物種資源的可持續利用，對人類生存和生活也都具有重要的現實和潛在的意義［5］。
1.2 濕地保護類型
濕地是位于陸生生態系統和水生生態系統之間的過渡性地帶，在土壤浸泡在水中的特定環境下，生長著很多濕地的特征植物。濕地廣泛分布于世界各地，擁有眾多野生動植物資源，是重要的生態系統。很多珍稀水禽的繁殖和遷徙離不開濕地，因此濕地被稱為“鳥類的樂園”。濕地強大的生態凈化作用，因而又有“地球之腎”的美名。根據《自然保護區類型與級別劃分原則》(GB/T 14529-93)，衡水湖國家級自然保護區屬于自然生態系統類的濕地類型自然保護區［6］。從生態系統特征上看屬于以華北內陸淡水濕地生態系統為主的平原復合濕地生態系統。
2 濕地生物多樣性功能評價方法
生物多樣性的3個主要層次是物種多樣性、基因多樣性和生態系統多樣性。這是組建生物多樣性的3個基本層次。基因多樣性代表生物種群之內和種群之間的遺傳結構的變異。每一個物種包括由若干個體組成的若干種群。各個種群由于突變、自然選擇或其他原因，往往在遺傳上不同。因此，某些種群具有在另一些種群中沒有的基因突變，或者在一個種群中很稀少的等位基因可能在另一個種群中出現很多。在同一個種群之內也有基因多樣性，在一個種群中某些個體常常具有基因突變。生態系統多樣性既存在于生態系統之間，也存在于一個生態系統之內。總之，物種多樣性是生物多樣性最直觀的體現，是生物多樣性概念的中心。基因多樣性是生物多樣性的內在形式，一個物種就是一個獨特的基因庫，可以說每一個物種就是基因多樣性的載體；生態系統的多樣性是生物多樣性的外在形式，保護生物的多樣性，最有效的形式是保護生態系統的多樣性［7-9］。
作為水陸相兼的生態系統，濕地的獨特生境使它同時兼具豐富的陸生與水生動物植物資源，對于保護物種，維持生物多樣性具有難以替代的生態價值。濕地生物多樣性是所有濕地生物種種內遺傳變異和它們生存環境的總稱，包括所有不同種類的動物、植物、微生物及其所擁有的基因和它們與環境所組成的生態系統［12］。
物種多樣性是群落生物組成結構的重要指標，它不僅可以反映群落組織化水平，而且可以通過結構與功能的關系間接反映群落功能的特征。
在濕地生態系統評價方法的基礎上，結合生物多樣性的理論和實踐，將物種多樣性和生物多樣性作為一級指標，下設二級、三級亞指標，建立可操作性較強的濕地生物多樣性評價指標體系［13］，見表1。
人類威脅程度分值
對資源保護部構成威脅5保護區與未開發生境毗鄰5
資源的有效保護受到一定的威脅3保護區周邊尚有未開發生境3
資源的有效保護受到較大的威脅1保護區被已開發的區域環繞1
根據濕地生物多樣性現狀調查結果，對照以上賦值逐項打分，將所得分數累加即得到該濕地生物多樣性評價總分值。計算公式為：
R=∑3i=1Ai+∑3j=1Bj(1)
式中：R-濕地生物多樣性總分值；A-物種多樣性分值；i-物種多樣性評價項目數；B-生態系統多樣性分值；j-生物多樣性評價項目。
根據R值的高低，將濕地生物多樣性劃分為5級，見表8。轉貼于 3 衡水湖生物多樣性評價
衡水湖是華北平原上第一個內陸淡水湖國家級自然保護區，同時也是華北平原唯一保持沼澤、水域、灘涂、草甸和森林等完整濕地生態系統的自然保護區［14］。豐富的生物資源是衡水湖的支柱。這里有綠藻、藍綠藻和硅藻等在內的201種浮游植物、平均密度達到了4 000個/L，浮游動物174種、平均密度達到了4 000個/L；這里有蘆葦等挺水植物，藕、睡蓮屬等漂浮有葉植物，眼子菜屬、黑藻屬等深水植物；這里有兩棲綱、爬行綱、哺乳綱野生動物共30多種。所以，衡水湖被稱作“物種基因庫”。
根據調查結果，衡水湖濕地有維管植物366種，鳥類286種，分別占河北省物種總數的42.2%和57.2%。維管束植物有國家三級重點保護植物野大豆；鳥類有國家一級重點保護的7種，有黑鸛、東方白鶴、丹頂鶴、白鶴、金雕、白肩雕、大鴇。生物多樣性評價結果為：
物種多度：A1=A11+A12=7.5+10=17.5
物種豐度：A2=A21+A22=10+7.5=17.5
物種稀有性：A3=A31+A32=2+4=6
則物種多樣性為：
A=∑3i=1Ai=17.5+17.5+6=41
衡水湖濕地大多數植物屬于世界廣布種；在調查的鳥類中，廣布種占總數的23.1%，古北種占種數的68.9%，東洋種占8.0%。衡水湖為沼澤蘆葦香蒲生態系統，在華北屬常見生境類型；生態系統的組成結構簡單、類型單一。衡水湖受人類影響因素較多，對濕地內水體、生物等資源影響較大；濕地周圍為村鎮和農田，沒有未被開發的區域。生態系統多樣性評價結果如下。
生態系統多樣性地區分布：
B1=B11+B12=4+4=8
生態系統多樣性生境類型：
B2=B21+B22=2+6=8
生態系統多樣性人類威脅評分：
B3=B31+B32=1+1=2
則生態系統多樣性為：
B=∑3i=1Bi=8+8+2=18
濕地生物多樣性評價總分為：
R=∑3i=1Ai+∑3j=1Bj=41+18=59
按照濕地生物多樣性評分標準，衡水湖濕地生物多樣性功能進行評價，評價結果為：物種多樣性為41分，生物系統多樣性為18分，衡水湖濕地生物多樣性處于一般水平［15］。從分析結果可以看出，衡水湖濕地物種多樣性占優勢，而生態系統多樣性占劣勢，生態環境受人類活動影響因素較大。
4 結論
利用衡水湖生物多樣性資料，對衡水湖生物多樣性功能進行評價。分別對物種多度、物種豐度和物種稀有性進行分析，計算出物種多樣性；對生態系統多樣性地區分布、生態系統多樣性生境類型和生態系統多樣性人類威脅等指標分析，計算出生態系統多樣性指標。按照濕地生物多樣性評分標準，衡水湖濕地生物多樣性處于一般水平。生物多樣性是自然生態系統生產和生態服務的基礎和源泉。生物多樣性可提供多方位的服務。人類歷史上大約有3 000種植物被用作食物，估計有75 000種植物可作食用。人類就是依賴這些植物得以繁衍。生物技術是以現有生物多樣性為物質基礎的工作，在解決糧食短缺、人類健康、維護生物物種和環境等諸多社會經濟重大問題中將發揮重要作用，將成為21世紀國民經濟的支柱產業。
參考文獻
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