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高效液相色譜范文1

關(guān)鍵詞：葛粉;葛根素;HPLC

Abstract:Object:DeterminationofPuerariainPuerariaPowderMethods:PuerariaweredeterminedbyHPLC.ThemobilephasewasMeOH－H2O－HAc（30：70：0.5）.Detectionwavelengthwasat250nm.Results:Puerariashowedagoodlinearrelationship.Theaveragerecoverywas98.6%andRSDwas1.76%.Conclusion:Thismethodwassimple,quickandaccurate.

Keywords:PuerariaPowder;Pueraria;HPLC

葛根為豆科植物野葛Puerarialobata(Willd.)Ohwi的干燥根,是常用中藥材,具有解肌退熱，生津，透疹，升陽(yáng)止瀉功效，用于外感發(fā)熱頭痛、項(xiàng)背強(qiáng)痛，口渴，消渴，麻疹不透，熱痢，泄瀉，高血壓頸項(xiàng)強(qiáng)痛等[1]。現(xiàn)代研究證實(shí)，葛根中的主要有效成分為葛根素等異黃酮類化合物，具有抗炎解熱、擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈血管、增加冠狀動(dòng)脈血流量的作用，同時(shí)也有降低血壓的作用。有關(guān)葛根中葛根素等異黃酮的含量測(cè)定研究已有不少報(bào)道[2-5]，但對(duì)葛粉中葛根素含量測(cè)定報(bào)道不多。本文對(duì)葛粉中葛根素的提取條件和測(cè)試條件等進(jìn)行比較研究,并采用高效液相色譜法對(duì)葛粉樣品進(jìn)行了定量分析,結(jié)果令人滿意。

1實(shí)驗(yàn)部分

1.1儀器與試劑

島津LC－10Atvp高效液相色譜儀；SPD－10Avp紫外檢測(cè)器；島津UV－265紫外分光光度儀，多功能榨汁機(jī)/攪拌機(jī)SG300－I（上海科駿電器有限公司）。甲醇（色譜純），水（二次蒸餾），其余均為分析純。葛根素對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所）；鮮葛（浙江省永嘉縣潘坑鄉(xiāng)）。

1.2色譜條件

用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；色譜柱C18diamonsil5ul(150×4.6mmI.D)，MeOH－H2O－HAc（30：70：0.5）為流動(dòng)相，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)250nm。

2結(jié)果與討論

2.1提取溶劑濃度的選擇

精密稱取同一樣品約0.1g,分別加30%乙醇、50%乙醇和80%乙醇10ml，超聲提取60分鐘，進(jìn)樣5ul,比較峰面積，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明30%乙醇提取最好。

2.2超聲提取時(shí)間的選擇

精密稱取同一樣品約0.1g,分別加30%乙醇10ml，超聲提取30分鐘、45分鐘、60分鐘，進(jìn)樣5ul,比較峰面積，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明超聲60分鐘為最佳提取條件。

2.3流動(dòng)相及流速的選擇

試驗(yàn)時(shí)曾采用下述流動(dòng)相進(jìn)行測(cè)定：甲醇－水（25：75）、甲醇－水－醋酸（30：70：0.5）、甲醇－水（30：70）為流動(dòng)相，結(jié)果采用甲醇－水－冰醋酸（30：70：0.5）為流動(dòng)相，樣品分離好。而流速也以1.0ml/min為合適。

2.4標(biāo)樣溶液的制備

稱取一定量葛根素對(duì)照品,用30%乙醇溶解配制成濃度為13ug/ml的葛根素標(biāo)準(zhǔn)液。

2.5葛粉制備

取鮮葛用水洗凈切片,稱取20g放入攪拌機(jī)內(nèi)，攪拌三次，每次1分鐘，每次加水200ml，150ml，100ml，合并漿汁放置二天，去掉上面的水，下面的粉漿用定量濾紙過(guò)濾，低溫干燥，放入干燥器中備用。

2.6供試品溶液制備

精確稱取一定量葛粉于10mL容量瓶中,加30%乙醇10ml,超聲提取1h,濾紙過(guò)濾,濾液過(guò)0.45um濾膜作為供試品溶液。

2.7線性關(guān)系考察

在上述色譜條件下，分別進(jìn)標(biāo)樣溶液0.5、3、5、7、10μl，測(cè)得各峰面積。以葛根素為橫座標(biāo)（A），以峰面積（Y）為縱座標(biāo)，計(jì)算得回歸方程：Y=3.90×106x+728.14,相關(guān)系數(shù)r＝0.9999；結(jié)果紫外檢測(cè)葛根素在0.0065-0.13μg范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

2.8精密度試驗(yàn)

取上述標(biāo)樣溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，測(cè)定，RSD為1.11%。

2.9重復(fù)性試驗(yàn)

取同一樣品重復(fù)測(cè)定5次，RSD為1.61%。

2.10穩(wěn)定性試驗(yàn)

取上述供試品溶液，0、2、5、7、10h進(jìn)樣，RSD為2.1%，10小時(shí)內(nèi)進(jìn)樣穩(wěn)定。

2.11回收率試驗(yàn)

取已知含量的樣品，分別加入葛根素標(biāo)樣，按上述方法測(cè)定5次，平均回收率為98.6%,RSD為1.76%。見(jiàn)表1。

2.12樣品分析

精密吸取標(biāo)樣溶液5μl與供試品溶液5μl，注入液相色譜儀，測(cè)定，結(jié)果:葛粉中葛根素的含量為0.06%（n=3），見(jiàn)下圖。

3討論

本文采用高效液相色譜法測(cè)定葛粉中葛根素的含量,方法簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確，結(jié)果滿意，可用于葛粉中葛根素的含量測(cè)定。

[參考文獻(xiàn)]

[1]中國(guó)藥典2005版一部.2005:233-234.

[2]章育中，楊凡。高效液相色譜法測(cè)定葛根及其片劑中異黃酮的含量.藥物分析雜志，1984,4(2):67.

[3]張蕾,潘揚(yáng)，朱蓉貞，等。不同品種及產(chǎn)地的葛根中葛根素含量的比較。中國(guó)中藥雜志，1995,20(7):399.

高效液相色譜范文2

【摘要】

目的： 建立夏枯草的指紋圖譜分析方法，并對(duì)不同產(chǎn)地的夏枯草進(jìn)行指紋圖譜的比較研究。方法：以齊墩果酸為參照，采用高效液相色譜法，色譜柱為Hypersil C18，流動(dòng)相為甲醇：水：醋酸（86：14：0.1），檢測(cè)波長(zhǎng)為208nm，流速為1ml/min。結(jié)果： 標(biāo)出10個(gè)主要共有峰，方法學(xué)考察表明，本研究建立的分析方法有較好的重現(xiàn)性，比較了不同產(chǎn)地夏枯草藥材與標(biāo)準(zhǔn)藥材指紋圖譜的相似性。結(jié)論： 方法穩(wěn)定、可靠、簡(jiǎn)便，為提高夏枯草藥材質(zhì)量控制提供依據(jù)。

【關(guān)鍵詞】 夏枯草； 高效液相色譜； 指紋圖譜

夏枯草為唇形科植物夏枯草Prunella vulgaris L.的干燥果穗，我國(guó)各地均產(chǎn)，主產(chǎn)于江蘇、浙江、安徽、河南等地［1］。夏枯草臨床應(yīng)用廣泛，藥典中載有“清火、明目、散結(jié)、消腫”［2］之功效，現(xiàn)代研究表明夏枯草還具有降血脂，降血糖，免疫抑制以及抗腫瘤等作用［3］。目前，市場(chǎng)上夏枯草產(chǎn)地多，質(zhì)量不一，缺乏統(tǒng)一質(zhì)量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，通常采用測(cè)定其中一、兩種化合物含量的方法來(lái)進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)，不足以全面反映藥材的整體質(zhì)量。本研究利用高效液相色譜法對(duì)夏枯草進(jìn)行了指紋圖譜的研究，結(jié)果表明，本方法穩(wěn)定、可靠、重現(xiàn)性好，可為夏枯草藥材質(zhì)量控制提供有效的參考依據(jù)。

1 儀器與試藥

日立高效液相色譜儀，DAD檢測(cè)器，EZChrom Elite色譜工作站；KQ100A型超聲波清洗器；電子天平。

夏枯草對(duì)照藥材及齊墩果酸對(duì)照品由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供。夏枯草藥材分別購(gòu)自各地藥材市場(chǎng)和藥店，經(jīng)鑒定為夏枯草藥材的干燥果穗。

甲醇為色譜純，其它試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Hypersil C18，4.6*250mm，10μm；流動(dòng)相：甲醇：水：醋酸（86：14：0.1）；檢測(cè)波長(zhǎng)為208nm；流速為1ml/min。

2.2 供試品溶液的制備

將夏枯草藥材擇去雜質(zhì)，60℃恒溫干燥，粉碎機(jī)粉碎，粉末過(guò)40目篩，反復(fù)進(jìn)行，直至藥材粉碎全部過(guò)篩為止。精密稱定夏枯草藥材粉末約1g，加入90%甲醇20ml，超聲30min，過(guò)濾，洗滌，合并濾液和洗液，揮干溶劑，殘?jiān)恿鲃?dòng)相溶解定容至10.00ml，溶液用微孔濾膜過(guò)濾，得夏枯草液，10μl進(jìn)樣。

2.3 流動(dòng)相的選擇

試驗(yàn)過(guò)程中，系統(tǒng)比較了不同配比的甲醇水（80：20；84：16；86：14；88：12）和乙腈水（80：20；85：15；90：10）及添加劑的用量。結(jié)果表明，以甲醇：水：醋酸（86：14：0.1）為流動(dòng)相系統(tǒng)效果較佳。

2.4 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

試驗(yàn)采用DAD檢測(cè)器，在波長(zhǎng)190～400nm范圍內(nèi)進(jìn)行夏枯草樣品的吸收情況考察。通過(guò)比較各不同保留時(shí)間的峰的紫外吸收光譜，得知多數(shù)峰的最大吸收在203～210nm范圍，少數(shù)在230nm附近，綜合比較各波長(zhǎng)處的色譜圖，最終確定208nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.5 參比峰的選擇

為消除測(cè)定結(jié)果的系統(tǒng)誤差，選取與其它組份分離較好、峰形對(duì)稱、保留時(shí)間24.617min的色譜峰作為參比峰（經(jīng)與標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖譜及紫外吸收?qǐng)D譜對(duì)照，得知此組份為齊墩果酸），以便計(jì)算夏枯草藥材共同特征組份的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)含量［4］。

夏枯草標(biāo)準(zhǔn)藥材的色譜圖及齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖見(jiàn)圖1和圖2。

2.6 方法學(xué)驗(yàn)證

2.6.1 精密度試驗(yàn) 同一夏枯草樣品液，在相同條件下，重復(fù)進(jìn)樣5次，得到色譜圖，計(jì)算保留時(shí)間和峰面積的RSD%。結(jié)果見(jiàn)表1。

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2.6.2 重現(xiàn)性試驗(yàn) 同一夏枯草樣品在相同條件下平行提取5份，分別進(jìn)樣，得到色譜圖，計(jì)算保留時(shí)間和峰面積的RSD%。結(jié)果見(jiàn)表2。

2.6.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 同一夏枯草樣品液分別于0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h、24h進(jìn)樣，計(jì)算所得色譜圖中各相對(duì)應(yīng)的保留時(shí)間和峰面積的RSD%。結(jié)果見(jiàn)表3。

圖1 夏枯草標(biāo)準(zhǔn)藥材色譜圖（略）

圖2 齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖（略）

表1 精密度試驗(yàn)（略）

表2 重現(xiàn)性試驗(yàn)（略）

表3 穩(wěn)定性試驗(yàn)（略）

2.7 夏枯草HPLC指紋圖譜的建立

按供試品的制備和檢測(cè)方法，對(duì)31份夏枯草藥材分別測(cè)定色譜圖。比較各夏枯草藥材的色譜圖，結(jié)合各組份峰的紫外吸收特征，確定相同組份峰，計(jì)算各組份相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積。

αi=ti / ts ，α為相對(duì)保留時(shí)間，ts為內(nèi)參峰保留時(shí)間，ti為其它組分保留時(shí)間。

Ar=Ai×100/∑A ，Ar為相對(duì)面積值，Ai為各組分面積值，ΣA為總峰面積。

選取10個(gè)主要共有峰為特征峰，其面積和占到總面積的99%以上，建立夏枯草樣品藥材的HPLC相對(duì)保留值指紋圖譜。結(jié)果見(jiàn)表4，其中αi為31種樣品譜圖中相同組份的相對(duì)保留時(shí)間值的平均值。

2.8 夏枯草HPLC指紋圖譜相似度的計(jì)算

以10批夏枯草對(duì)照藥材的HPLC圖譜為標(biāo)準(zhǔn)，用計(jì)算機(jī)輔助中藥指紋圖譜相似度計(jì)算軟件計(jì)算31個(gè)夏枯草樣品藥材的HPLC圖譜與對(duì)照藥材的相似度。結(jié)果見(jiàn)表5。

表4 夏枯草樣品藥材的HPLC相對(duì)保留值指紋圖譜（略）

表5 樣品相似度計(jì)算結(jié)果（略）

3 討論

對(duì)夏枯草的高效液相色譜條件進(jìn)行了考察，包括流動(dòng)相的組成、配比等，并依據(jù)不同保留時(shí)間峰的紫外吸收特征確定檢測(cè)波長(zhǎng)。確定色譜條件為：流動(dòng)相為甲醇水醋酸（86：14：0.1）；流速為1ml/min；進(jìn)樣量為10μl；檢測(cè)波長(zhǎng)為208nm。在此色譜條件下，基線穩(wěn)定，各峰得到了較好的分離，峰形、保留時(shí)間等也較好。

對(duì)中藥夏枯草的HPLC指紋圖譜進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，建立了31種夏枯草樣品藥材的HPLC相對(duì)保留值指紋圖譜，并進(jìn)行了夏枯草樣品藥材與標(biāo)準(zhǔn)藥材相似度的研究。為夏枯草藥材的質(zhì)量控制提供了依據(jù)，為建立規(guī)范化的夏枯草種植基地提供了有效的質(zhì)量控制手段。

【參考文獻(xiàn)】

1 鄭漢臣，蔡少青．藥用植物學(xué)與生藥學(xué).北京：人民衛(wèi)生出版社，2004，389．

2 國(guó)家藥典委員會(huì)，中華人民共和國(guó)藥典（一部）.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005，197～198．

高效液相色譜范文3

關(guān)鍵詞：咽炎方含片；指紋圖譜；高效液相色譜法

咽炎方含片由廣東土牛膝、崗梅根和甘草組成，用于治療急慢性咽炎、咽喉腫痛、扁桃體炎，是中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院臨床應(yīng)用多年的經(jīng)驗(yàn)方。方中廣東土牛膝、崗梅根均為廣東地產(chǎn)藥材，其化學(xué)成分、尤其是有效成分或標(biāo)志性化合物尚未明確，給有效控制及評(píng)價(jià)該制劑的質(zhì)量帶來(lái)了一定的困難。鑒于指紋圖譜技術(shù)是一種多組分復(fù)雜樣品質(zhì)量評(píng)價(jià)的有效方法，本試驗(yàn)擬建立該制劑的中藥高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜，以便更全面地控制該制劑的質(zhì)量。

1 儀器與試藥

Waters 515液相色譜儀，AL204型電子天平（瑞士METTLER- TOLEDO公司）。

甘草苷對(duì)照品（批號(hào)111610-200604）購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所，乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為重蒸餾水。咽炎方含片樣品為中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥學(xué)部自制。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

采用Phenomenex C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為0.2%磷酸溶液（A）-乙腈（B）。梯度洗脫程序?yàn)椋?～30 min， 85%～75%A；30～40 min，75%～65%A；40～50 min，65%～85%A；50～60 min，85%A。檢測(cè)波長(zhǎng)為203 nm，柱溫為室溫，流速為1.0 mL/min。

基金項(xiàng)目：廣東省重大科技專項(xiàng)（2011A080300004）

通訊作者：任斌，E-mail：

2.2 供試品溶液的制備

取20 片咽炎方含片，研細(xì)，取約6.0 g 片粉，精密稱定，置100 mL量瓶中，加50%甲醇至90 mL，超聲（1 200 W，20 kHz）處理15 min，放冷，加50%甲醇至刻度，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得[1]。

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1 精密度試驗(yàn) 取同一批號(hào)（20100201）樣品，按“2.2”項(xiàng)下方法操作，在上述色譜條件下，重復(fù)進(jìn)樣5次，記錄指紋圖譜。結(jié)果各色譜峰對(duì)參照峰（7號(hào)峰，甘草苷）相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD值均小于4.0%，符合指紋圖譜要求。

2.3.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號(hào)（20100201）樣品5份，按“2.2”項(xiàng)下方法操作，在上述色譜條件下進(jìn)樣分析，計(jì)算各色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，其RSD值均小于3.6%，符合指紋圖譜要求。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批號(hào)（20100201）樣品，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，于室溫下放置，分別在0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣分析，計(jì)算各色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，其RSD值均小于2.7%。結(jié)果表明，咽炎方含片樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4 指紋圖譜的建立

2.4.1 特征峰的確定 在上述色譜條件下，測(cè)定10批咽炎方含片，記錄圖譜。對(duì)10批供試品結(jié)果進(jìn)行分析比較，標(biāo)定了9個(gè)共有指紋峰，典型色譜圖見(jiàn)圖1。2、4、6號(hào)峰來(lái)源于廣東土牛膝，1、5、9號(hào)峰來(lái)源于崗梅根，3、7、8號(hào)峰來(lái)源于甘草。

2.4.2 參照峰的選擇 保留時(shí)間為25.1 min的7號(hào)色譜峰峰面積較大，出峰時(shí)間適中且穩(wěn)定，經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照認(rèn)定為甘草苷的吸收峰，因此選擇甘草苷作為HPLC指紋圖譜的參照峰，以其保留時(shí)間和峰面積為1.0，計(jì)算各批指紋峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，結(jié)果見(jiàn)表1、表2。

2.4.3 相似度分析 采用國(guó)家藥典委員會(huì)的中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)軟件（版本2004 A），對(duì)10批咽炎方含片的指紋圖譜進(jìn)行分析，以色譜峰的平均值建立對(duì)照指紋圖譜，利用相關(guān)系數(shù)法計(jì)算指紋圖譜的相似度，結(jié)果見(jiàn)表3。

3 討論

本研究考察了3種不同型號(hào)色譜柱：Hypersil BDS C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Diamond C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Phenomenex Luna C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）。結(jié)果表明， Phenomenex Luna C18柱分離出的色譜峰分離度好、峰數(shù)多、穩(wěn)定性好。故選擇 Phenomenex Luna C18柱為分析色譜柱。

試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，采用常規(guī)的水浴（50 ℃）攪拌法，咽炎方含片完全溶解需40 min，而采用50%甲醇超聲處理，只需15 min即可完全溶解。超聲處理法不但能加快含片的溶解速度，省時(shí)、節(jié)能，最主要的是能避免加熱導(dǎo)致的熱敏成分的破壞。因此采用50%甲醇超聲處理15 min來(lái)溶解咽炎方含片。

咽炎方含片中崗梅根主要含有皂苷類成分，紫外吸收波長(zhǎng)短。為使各被測(cè)組分均有較大吸收，選用203 nm為指紋圖譜檢測(cè)波長(zhǎng)[2]。比較乙腈-磷酸水溶液和甲醇-磷酸水溶液系統(tǒng)下的色譜圖，結(jié)果乙腈-磷酸水溶液系統(tǒng)梯度洗脫的柱壓較低，流動(dòng)相的改變對(duì)其基線影響較小。

各批次藥材的來(lái)源、質(zhì)量對(duì)指紋圖譜有明顯影響。根據(jù)相似度分析結(jié)果，結(jié)合色譜峰面積相對(duì)于稱樣量與平均片重量化，相似度在0.90以上的樣品質(zhì)量較好，0.90以下的為質(zhì)量較差[3]。批次2、3、4、6、7、8、9、10樣品指紋圖譜相似度為0.949 0～0.990 2，說(shuō)明各批次咽炎方含片之間具有較好的相似性，樣品質(zhì)量較好，而批次1、5樣品指紋圖譜相似度小于0.90，說(shuō)明質(zhì)量較差。

本試驗(yàn)建立了咽炎方含片的HPLC指紋圖譜，確定了9個(gè)共有峰，計(jì)算了10 批咽炎方含片的指紋圖譜的相似度。同時(shí)，本試驗(yàn)明確了9個(gè)共有峰的原藥材歸屬，為咽炎方含片的定量指標(biāo)的選擇和確定提供了參考。本試驗(yàn)建立的咽炎方含片指紋圖譜具有重復(fù)性好、特征性強(qiáng)、方法簡(jiǎn)便等特點(diǎn)，為咽炎方含片的質(zhì)量控制奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1] 韋炳華，李瑞明，盧進(jìn)，等.咽炎方含片的制備工藝研究[J].今日藥學(xué)， 2012，22（5）：272-273.

[2] 盧進(jìn)，任斌，陳孝.廣東崗梅藥材的HPLC指紋圖譜研究[J].熱帶醫(yī)學(xué)雜志，2011，11（5）：550-552.

高效液相色譜范文4

關(guān)鍵詞：綠谷隆；反相高效液相色譜；外標(biāo)法

1 概述

綠谷隆純品為白色結(jié)晶固體，是一種用于防除禾谷類及玉米田中雜草的除草劑，目前國(guó)內(nèi)尚無(wú)綠谷隆的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)綠谷隆的物化性質(zhì)和實(shí)際生產(chǎn)的需要，我們選擇高效液相色譜法進(jìn)行定量分析，該方法具有較高的精密度和準(zhǔn)確度，且快速、準(zhǔn)確，可作為綠谷隆的產(chǎn)品檢驗(yàn)分析方法。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

島津LC-20AT具紫外可變波長(zhǎng)檢測(cè)器，色譜工作站，綠谷隆標(biāo)準(zhǔn)品≥98%，甲醇HPLC，新蒸二次蒸餾水，色譜柱：150mm×4.6mm×5μm，C18不銹鋼柱，進(jìn)樣針：100μL。

2.2 液相色譜操作條件

流動(dòng)相：甲醇+水=70+30（V/V），柱溫：（25±5）℃，檢測(cè)波長(zhǎng)：254nm。流速： 1.0ml/min。保留時(shí)間：綠谷隆約：7.1min，綠谷隆標(biāo)準(zhǔn)品分離見(jiàn)圖1，樣品分離見(jiàn)圖2。

2.3 測(cè)定步驟與計(jì)算

2.3.1 測(cè)定步驟

（1）標(biāo)準(zhǔn)溶液的的配制。準(zhǔn)確稱取約0.1g（精確到±0.0001g）綠谷隆標(biāo)準(zhǔn)品于50ml容量瓶中，用甲醇在超聲波中溶解，取出冷卻至室溫，用甲醇稀釋到刻度并搖勻。用移液管準(zhǔn)確移取2.00ml該溶液于50ml容量瓶中，用流動(dòng)相稀釋定容至刻度，搖勻備用。

（2）樣品溶液的配制。準(zhǔn)確稱取約0.1g（精確到±0.0001g）綠谷隆樣品于50ml容量瓶中，用甲醇在超聲波中溶解，取出冷卻至室溫，用甲醇稀釋到刻度并搖勻。用移液管準(zhǔn)確移取2.00ml該溶液于50ml容量瓶中，用流動(dòng)相稀釋定容至刻度，搖勻備用。

（3）測(cè)定。在上述色譜條件下，待儀器穩(wěn)定后，連續(xù)注入綠谷隆標(biāo)準(zhǔn)溶液于色譜柱內(nèi)，待相鄰兩針的綠谷隆標(biāo)樣峰面積變化小于1.0%時(shí)，按下列順序進(jìn)行色譜分析：標(biāo)樣溶液、樣品溶液、樣品溶液、標(biāo)樣溶液。

2.3.2 計(jì)算

將測(cè)得兩針試樣溶液以及試樣前后兩針標(biāo)樣溶液中綠谷隆的峰面積分別進(jìn)行平均，試樣中綠谷隆質(zhì)量百分含量X按下式計(jì)算：

式中：r1-標(biāo)樣中綠谷隆的峰面積；r2-試樣中綠谷隆的峰面積；m1-標(biāo)樣的質(zhì)量，g；m2-樣品的質(zhì)量，g；P-標(biāo)樣中綠谷隆的質(zhì)量百分含量%；

允許誤差：兩次平行測(cè)定結(jié)果之差小于0.5%，取其平均值作為樣品中綠谷隆的百分含量。

2.4 結(jié)果與討論

2.4.1 色譜條件的確定

（1）分離方法及檢測(cè)器的選擇。經(jīng)過(guò)反復(fù)實(shí)驗(yàn)證明，綠谷隆在HPLC反相C18柱上分離效果和峰形良好，保留時(shí)間短，因此選用反相HPLC法分析。紫外檢測(cè)器是高效液相色譜儀中應(yīng)用最廣泛的檢測(cè)器，它靈敏度高，噪音低，線性范圍寬，對(duì)流速和溫度均不敏感，根據(jù)綠谷隆的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明，綠谷隆在紫外區(qū)內(nèi)有很大吸收，因此紫外檢測(cè)器可以作為分析綠谷隆的首選檢測(cè)器。

（2）溶劑的選擇。反相色譜法：固定相（填料）為非極性，流動(dòng)相為極性。對(duì)應(yīng)的色譜柱：烷基硅烷化鍵合硅膠填料，如C18（ODS）C8，C4，C3，苯基等。反相色譜中最常用的流動(dòng)相及其洗脫強(qiáng)度：水

（3）流動(dòng)相配比的選擇。綠谷隆在流動(dòng)相甲醇+水=80+20（V/V）時(shí)，保留時(shí)間過(guò)短，分離效果較差，在流動(dòng)相甲醇+水=70+30時(shí)，峰形對(duì)稱，分離效果良好，保留時(shí)間適中，且綠谷隆在甲醇中都有很好的溶解度，因此確定流動(dòng)相甲醇+水=70+30為流動(dòng)相操作條件。

（4）波長(zhǎng)的選擇。通過(guò)對(duì)綠谷隆吸收曲線的測(cè)定，綠谷隆在波長(zhǎng)254nm和220nm處，都有很強(qiáng)的響應(yīng)；在波長(zhǎng)220nm處，吸收太強(qiáng)，峰高太高，超出檢測(cè)器線性范圍，若減少稱樣量或進(jìn)樣量，會(huì)影響結(jié)果的精密度和準(zhǔn)確度；在254nm處，樣品的稱樣量和峰高的比例適中，所以最后選擇254nm作為綠谷隆的測(cè)定最佳波長(zhǎng)。

2.4.2 方法的線性范圍

準(zhǔn)確稱取不同質(zhì)量的綠谷隆標(biāo)準(zhǔn)品配成不同濃度的溶液，在2.2色譜操作條件下測(cè)定，線性回歸方程為：Y=06X+7E+58477，相關(guān)系數(shù)R2=0.9994。

2.4.3 精密度的測(cè)定

用同一樣品在規(guī)定色譜條件下進(jìn)行多次測(cè)定，其結(jié)果如表1所示：

表1 精密度測(cè)定結(jié)果數(shù)據(jù)表

2.4.4 回收率的實(shí)驗(yàn)

用綠谷隆標(biāo)樣加入到已知含量的綠谷隆的樣品中，在規(guī)定的色譜條件下測(cè)定其回收加入率。結(jié)果如表2所示：

由23可知綠谷隆的回收率在98.8-100.4之間，說(shuō)明方法的準(zhǔn)確度較好。

3 結(jié)束語(yǔ)

利用反相高效液相色譜的外標(biāo)法測(cè)定了綠谷隆的含量。該方法簡(jiǎn)便、快速，具有較高的精密度和準(zhǔn)確度，是一種較好的優(yōu)化方案，可以作為綠谷隆產(chǎn)品的質(zhì)量分析。

參考文獻(xiàn)

[1]杭州大學(xué).分析化學(xué)手冊(cè)（第二分冊(cè)）化學(xué)分析[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2001.

高效液相色譜范文5

關(guān)鍵詞：谷氨酰胺 高效液相色譜法 測(cè)定

中圖分類號(hào)：R927 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1672-3791（2014）05（b）-0240-02

谷氨酰胺（Glutamin）亦被稱作麩酰胺酸，為人體中含量最豐富的非必需氨基酸。臨床上主要用于改善胃潰瘍和十二指腸潰瘍的癥狀。常見(jiàn)的分析方法有毛細(xì)管電泳法[1]。本文建立了通過(guò)高效液相色譜法測(cè)定谷氨酰胺的方法，實(shí)驗(yàn)證明該方法操作簡(jiǎn)便、專一性及靈敏度高，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

1 材料與方法

1.1 儀器

HLPC色譜儀型號(hào)：LC-20A，色譜儀編號(hào)：L20134506488AE，分析天平型號(hào)：AE100 分析天平編號(hào)：LS012，超聲波型號(hào)：AS3120A，檢測(cè)波長(zhǎng)：λ=215 nm。

1.2 色譜條件

檢測(cè)器型號(hào)：SPD-20A，檢測(cè)器靈敏度：2.0AUFS柱溫：35 ℃，進(jìn)樣體積：20 ul流速：1.0 ml/min，流動(dòng)相：0.05 moL/L的磷酸二氫鉀（取磷酸二氫鉀6.8 g，加水至1000 ml，用磷酸調(diào)節(jié)PH值為4.0）∶乙腈=70∶30，色譜柱：NH￠4.6×250 mm，色譜柱號(hào)：312316。

1.3 材料與試劑

乙腈（色譜純，康科德公司），磷酸二氫鉀（AR級(jí)），磷酸（AR級(jí)），谷氨酰胺對(duì)照品（山東寶生物技術(shù)有限公司），高純水。

1.4 樣品制備

標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備：精密稱取谷氨酰胺標(biāo)準(zhǔn)品250 mg于50 ml容量瓶中，用純化水稀釋并定容至刻度，搖勻，再精密吸取2 ml于10 ml容量瓶中，用流動(dòng)相稀釋定容至刻度，搖勻，備用。其濃度為1 mg/ml。

樣品溶液的制備：稱取本品約250 mg，精密稱定于50 ml容量瓶中，用純化水稀釋并定容至刻度，搖勻，再精密吸取2 ml于10 ml容量瓶中，用流動(dòng)相稀釋定容至刻度，搖勻，備用。其濃度為1 mg/ml。

1.5 測(cè)定方法

分別取標(biāo)準(zhǔn)品溶液和供試品溶液盛裝于2 ml自動(dòng)進(jìn)樣瓶中，進(jìn)行自動(dòng)進(jìn)樣（進(jìn)樣量為20 ul），注入液相色譜儀，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算供試品中谷氨酰胺的含量。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

在上述色譜條件下，取標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行自動(dòng)進(jìn)樣，連續(xù)進(jìn)樣6針，谷氨酰胺峰與其相鄰色譜峰的分離度均大于1.5；理論板數(shù)、拖尾因子，6次色譜峰峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）、六次色譜峰的保留時(shí)間分別為：9.80、9.79、9.79、9.78、9.70、9.71，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD=1.2%，小于2.0%；6次色譜峰面積分別為：1205488、10665、1200380、1204391、1170905、1186594，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.2%小于5%；拖尾因子分別為：1.2、1.2、1.3、1.4、1.4、1.4，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.7%均小于2%；理論塔板數(shù)分別為：4886、4867、5001、5185、5545、5867，均大于4000。

2.2 線性

用對(duì)照品制備不同濃度的樣品，使其濃度分別為0.5 mg/ml、0.75 mg/ml、1.0 mg/ml、1.25 mg/ml、1.5 mg/ml。每個(gè)濃度連續(xù)進(jìn)樣3針。以檢測(cè)得到的峰面積平均值、濃度作線性回歸，其線性回歸方程為y=1188457x，其中y為峰面積，x為谷氨酰胺濃度（見(jiàn)圖1），線性相關(guān)系數(shù)R2為0.999。結(jié)果表明在目標(biāo)濃度0.5 mg/ml～1.5 mg/ml內(nèi)，該方法具有良好的線性關(guān)系。

2.3 準(zhǔn)確度

分別制備濃度約為1 mg/ml的對(duì)照品溶液和濃度約為1 mg/ml的樣品溶液。分別吸取樣品溶液1 ml和標(biāo)準(zhǔn)溶液0.8 ml；樣品溶液1 ml和標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0 ml；樣品溶液1 ml和標(biāo)準(zhǔn)溶液1.2 ml分別加入10 ml容量瓶中，用流動(dòng)相稀釋定容至刻度，制備濃度分別為80%、100%、120%的三種濃度的混合溶液。每個(gè)濃度連續(xù)進(jìn)樣三針，記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該方法在三個(gè)濃度下其回收率分別為99.5%、97.6%、97.9%。平均回收率達(dá)到98.3%，表明該測(cè)定方法具有較高的檢測(cè)準(zhǔn)確度。

2.4 精密度

稱取標(biāo)準(zhǔn)品約250 mg，精密稱定于50 ml容量瓶中，用純化水稀釋并定容至刻度，搖勻，作為貯備液備用。再分別加標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液0.8 ml、1.0 ml、1.2 ml，用流動(dòng)相稀釋定容至刻度，搖勻，制成濃度分別為80%、100%、120%的三種濃度，備用。每個(gè)濃度連續(xù)進(jìn)樣三針，記錄色譜圖。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明三個(gè)實(shí)驗(yàn)下其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD分別為0.47%、0.42%、0.20%，平均相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD=0.37%。該結(jié)果表明該方法重現(xiàn)性較好。

2.5 專一性

從圖2可以看出，用該方法可以較好的分離測(cè)定谷氨酰胺的相關(guān)物質(zhì)如谷氨酸、焦谷氨酸等，具有專一性高的特點(diǎn)。

3 討論

本文建立的高效液相色譜法測(cè)定谷氨酰胺含量的方法，其檢測(cè)波長(zhǎng)為215nm，流動(dòng)相為0.05 mol/L的磷酸二氫鉀（用磷酸調(diào)節(jié)PH值為4.0）∶乙腈=70∶30，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該方法在其線性范圍內(nèi)具有專一性高，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確的特點(diǎn)。

高效液相色譜范文6

【Abstractobjective】TosetupamethodforqualitycontrolofFuyankangtablets.METHOD：HPLCmethodwasdevelopedtoquantitativedetermination.TheseparationwasperformedonAgilentTechnologiesZORBAXExtend-C184.6×250mm,5μm.Themobilephasewasacetonitrile-methanol-phosphatebuffer(pH=6.8)(16：16：68).Theflowratewas1.0ml·min-1.TheUVdetectionwavelengthwas220nm.Thecolumntemperaturewas30℃.RESULTS：ThelinearrangeofMatrineandOxgmatrinewereat0.02～0.40mg·ml-1(r=0.9995)and0.01～0.20mg·ml-1(r=0.9997)respectively,theaveragerecoveries(n=6)were98.2%and97.6%withRSD1.4%and2.2%.CONCLUSIONThemethodissimpleandaccurate,itcanbeusedforqualitycontrolofKangfulingcapsules.

【Keywords】HPLC；Kangfulingcapsules；Matrine；Oxgmatrine；Determination

康婦靈膠囊為《國(guó)家藥品監(jiān)督管理局標(biāo)準(zhǔn)（試行）》收載的品種，由苦參、杠板歸、黃柏、益母草、雞血藤、紅花龍膽、土茯苓、當(dāng)歸等8種中藥組成。具有清熱燥濕、活血化瘀、調(diào)經(jīng)止帶的功效，為婦科常用中藥[1]。苦參含有苦參堿、氧化苦參堿等成分，我們采用高效液相色譜法測(cè)定制劑中苦參堿、氧化苦參堿的含量，該項(xiàng)方法操作簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確可靠，可用于康婦靈膠囊的質(zhì)量控制論文。

1儀器與試藥

1.1儀器LC-2010A高效液相色譜儀，CLASS-VP色譜工作站。

1.2試藥苦參堿對(duì)照品（批號(hào)：100078-200414），氧化苦參堿對(duì)照品（批號(hào)：110780-200004），由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供，供含量測(cè)定用；康婦靈膠囊為市售樣品（貴州和仁堂藥業(yè)有限公司，規(guī)格：0.4g·粒－1，批號(hào)：20061108，20061202，20061216）。乙腈、甲醇為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

2方法與結(jié)果

2.1色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)色譜柱：AgilentTechnologiesZORBAXExtend-C184.6×250mm，5μm，流動(dòng)相：乙腈-甲醇-磷酸鹽緩沖液（PH6.8）（16:16:68），檢測(cè)波長(zhǎng)：220nm，流速：1.0ml/min，柱溫：30℃。

2.2溶液配制

2.2.1對(duì)照品溶液的制備精密稱取經(jīng)五氧化二磷減壓干燥12小時(shí)以上的苦參堿對(duì)照品和氧化苦參堿對(duì)照品各適量，分別加甲醇制成每1ml各含0.4mg的對(duì)照品貯備液；再精密量取苦參堿對(duì)照品貯備液和氧化苦參堿對(duì)照品貯備液各適量，加甲醇制成每1ml含苦參堿0.2mg、氧化苦參堿0.1mg的混合溶液，作為對(duì)照品溶液。

2.2.2樣品溶液的制備取康婦靈膠囊10粒內(nèi)容物，研細(xì)，取約1.0g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加濃氨溶液2ml使?jié)駶?rùn)，再加三氯甲烷（CHCl3）30ml，超聲處理（功率250W，頻率33KH2）20分鐘，濾過(guò)，取濾液，再用三氯甲烷洗滌殘?jiān)⑷萜骷盀V器4次，每次5ml，濾過(guò)，濾液合并，置水浴上蒸干，殘?jiān)眉状既芙獠⑥D(zhuǎn)移至25ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3陰性對(duì)照溶液的制備取除苦參以外的處方中其余藥材的十分之一量，按法制成片，再按樣品制備方法，制成陰性對(duì)照溶液。

2.3專屬性試驗(yàn)

分別精密吸取樣品溶液、陰性對(duì)照溶液及對(duì)照品溶液各10μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖（圖1）。由圖1可見(jiàn)，供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，有相同保留時(shí)間（1氧化苦參堿：6.866min；2苦參堿：15.422min）的色譜峰，陰性試驗(yàn)無(wú)干擾，證明本法可行。

2.4線性范圍考察

精密吸取對(duì)照品貯備液各適量，分別加甲醇配成濃度分別為苦參堿：0.02、0.05、0.10、0.20、0.30、0.40mg·ml－1，氧化苦參堿：0.01、0.03、0.05、0.10、0.15、0.20mg·ml－1的溶液，搖勻，濾過(guò)，精密吸取續(xù)濾液各10μl，注入液相色譜儀，記錄峰面積。以峰面積（A）為縱坐標(biāo)，其濃度（C）為橫坐標(biāo)，線性回歸，苦參堿回歸方程為：A=4.34×105C＋3.87×102，r=0.9995；氧化苦參堿回歸方程為：A=1.21×104C＋8.07×102，r=0.9997。結(jié)果表明，苦參堿在0.02～0.04mg·ml－1范圍內(nèi)峰面積與其濃度呈良好線性關(guān)系；氧化苦參堿在0.01～0.20mg·ml－1范圍內(nèi)峰面積與其濃度呈良好線性關(guān)系。

2.5精密度

取樣品（貴州和仁堂藥業(yè)有限公司，批號(hào)：20061108）按“2.2樣品溶液的制備”方法制備樣品溶液，重復(fù)進(jìn)樣5次，進(jìn)樣量10μl，在上述色譜條件下求得苦參堿峰面積RSD為0.9%，氧化苦參堿峰面積RSD為1.2%，表明精密度較好。

2.6穩(wěn)定性試驗(yàn)

取樣品（貴州和仁堂藥業(yè)有限公司，批號(hào)：20061108）溶液，在0、2、4、8、24h分別進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明樣品溶液在24h內(nèi)基本穩(wěn)定，苦參堿峰面積

的RSD為1.1%，氧化苦參堿峰面積的RSD為0.8%。

2.7重復(fù)性試驗(yàn)

取樣品（批號(hào)：20061108）共6份，分別按“2.2樣品溶液的制備”方法制備樣品溶液，進(jìn)行測(cè)定，求得苦參堿含量的RSD為0.7%，氧化苦參堿含量的RSD為1.6%，表明重復(fù)性較好。

2.8加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取已知含量的樣品（貴州和仁堂藥業(yè)有限公司，批號(hào)：20061108，苦參堿含量3.01mg·g－1，氧化苦參堿含量2.42mg·g－1，平均裝量0.3916g·粒－1）適量，共6份，分別置具塞錐形瓶中，分別精密加入苦參堿對(duì)照品溶液（0.2001mg·ml－1）、氧化苦參堿對(duì)照品貯備液（0.1000mg·ml－1）各適量，揮去甲醇，按“2.2樣品溶液的制備“方法操作，得回收率試驗(yàn)溶液，依法測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.9樣品含量測(cè)定

分別精密吸取供試品溶液與對(duì)照品溶液各10μl，注入液相色譜儀，測(cè)定三批樣品中苦參堿、氧化苦參堿峰面積，按外標(biāo)法計(jì)算其含量（n=5），結(jié)果見(jiàn)表2。根據(jù)三批樣品所測(cè)結(jié)果，暫定每粒康婦靈膠囊的苦參堿含量質(zhì)控定量限為1.8mg，氧化苦參堿含量質(zhì)控定量限為0.5mg。表1苦參堿、氧化苦參堿加樣回收率試驗(yàn)表2三批樣品含量測(cè)定結(jié)果

3討論

3.1流動(dòng)相的選擇筆者選擇了三種流動(dòng)相：①乙腈-0.1%磷酸溶液（20:80）（三乙胺調(diào)節(jié)PH值至8.0）[2]；②乙腈-甲醇-磷酸鹽緩沖液（PH6.8）-三乙胺（18:18:70:0.1）[2]；③乙腈-甲醇-磷酸鹽緩沖液（PH6.8）（16:16:68）。經(jīng)多次測(cè)試結(jié)果表明，前兩種流動(dòng)相所得峰形較寬，含雜質(zhì)多，而采用③乙腈-甲醇-磷酸鹽緩沖液（PH6.8）為流動(dòng)相所得樣品峰形好，干擾成分少，故選此做為含量測(cè)定的流動(dòng)相。

3.2溶劑的確定筆者比較了用甲醇溶解供試品及用流動(dòng)相溶解供試品，結(jié)果以甲醇為溶劑分離效果好，且保留時(shí)間短。

3.3通過(guò)對(duì)3批樣品中苦參堿、氧化苦參堿的測(cè)定，結(jié)果表明苦參堿最高含量為1.38mg·粒－1，最低為1.18mg·粒－1；氧化苦參堿最高含量為1.08mg·粒－1，最低為0.94mg·粒－1。綜合考慮確定限量，每粒含苦參堿不得低于1.8mg，含氧化苦參堿不得低于0.5mg。

本方法結(jié)果準(zhǔn)確，方法簡(jiǎn)便，重現(xiàn)性及回收率均理想，可以有效地控制產(chǎn)品質(zhì)量。

【參考文獻(xiàn)】