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摘要：目的建立加味三核顆粒的質(zhì)量控制方法。方法采用薄層色譜（TLC）法對(duì)加味三核顆粒中黃柏、補(bǔ)骨脂、蛇床子、水紅花子進(jìn)行定性鑒別；采用高效液相（HPLC）法測(cè)定加味三核顆粒中鹽酸小檗堿的含量，GeminiC18（4.6mm×250mm，5μm）色譜柱；乙腈∶0.1%磷酸溶液（50∶50）（每1000mL加十二烷基苯磺酸鈉0.1g）為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)265nm；進(jìn)樣量10μL；流速1.0mL/min。結(jié)果薄層鑒別的色譜圖斑點(diǎn)清晰，特征斑點(diǎn)專屬性強(qiáng)，陰性對(duì)照無(wú)干擾；鹽酸小檗堿進(jìn)樣量在640~6400ng與峰面積具有良好的線性關(guān)系，r=0.9998，平均回收率為100.56%，RSD=1.46%。結(jié)論所建的質(zhì)量控制方法簡(jiǎn)單、專屬性強(qiáng)，重現(xiàn)性好，可作為加味三核顆粒的質(zhì)量控制方法。
關(guān)鍵詞：加味三核顆粒；鹽酸小檗堿；高效液相色譜法；質(zhì)量控制
前列腺增生癥是引發(fā)中老年男性排尿障礙的一種常見良性疾病，在50歲人群中發(fā)病率為40%，在80歲以上人群中發(fā)病率接近90%，90歲以后人群發(fā)病率幾乎100%。我們目前逐步進(jìn)入人口老齡化階段，前列腺增生癥患者逐年增加，嚴(yán)重影響老年人的生活質(zhì)量，甚至還可能傷及腎臟，造成腎功能不全等后果[1]。加味三核顆粒是國(guó)醫(yī)大師王世民教授由經(jīng)典古方加味而成，由橘核、山楂核、荔枝核、黃柏、水紅花子等多味中藥組成的中藥制劑，治療前列腺增生療效顯著，極大地減輕了患者的病痛。本論文就加味三核顆粒的薄層定性鑒別、含量測(cè)定、方法學(xué)考察進(jìn)行研究，建立加味三核顆粒的完整、全面的質(zhì)量控制方法，為加味三核顆粒的質(zhì)量控制研究奠定一定的基礎(chǔ)。
1儀器與試劑
1.1儀器
美國(guó)Waterse2695高效液相色譜儀，Wa-ters2998紫外檢測(cè)器，Empower工作站；CAMAGTLCVISUALIZER薄層成像儀；CAMAGLINOMAT5半自動(dòng)點(diǎn)樣儀；瑞士METTLERAB135-S電子天平；SB-800DTD超聲波清洗機(jī)。
1.2試劑
乙腈、磷酸為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純；鹽酸小檗堿對(duì)照品（批號(hào)：110713-201915）；黃柏對(duì)照藥材（批號(hào)：121510-201807）；補(bǔ)骨脂對(duì)照藥材（批號(hào)：121056-201605）；蛇床子對(duì)照藥材（批號(hào)：121030-201808），以上標(biāo)準(zhǔn)品均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。
2方法與結(jié)果
2.1薄層鑒別
2.1.1黃柏的薄層鑒別
將樣品研磨成細(xì)粉狀，取3g于具塞錐形瓶中，加入20mL分析純甲醇，超聲波清洗機(jī)超聲30min后過濾取出，在水浴鍋上蒸干得到的濾液，加3mL分析純甲醇溶解殘?jiān)蟮玫降娜芤杭礊楣┰嚻啡芤骸Ａ砣↑S柏對(duì)照藥材2.0g，制備方法同供試品溶液，作為對(duì)照藥材溶液。再取黃柏陰性樣品3g，制備方法同供試品溶液，即得缺黃柏的陰性對(duì)照溶液[2，3]。參照2020版《中華人民共和國(guó)藥典》四部0502通則[4]下薄層色譜法，將制備好的3個(gè)批次供試品、黃柏對(duì)照藥材以及缺少黃柏的陰性對(duì)照溶液各吸取1μL，應(yīng)用薄層色譜點(diǎn)樣儀，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，點(diǎn)好的薄層板在內(nèi)含乙酸乙酯-甲酸-水（8∶1∶1）為展開劑的展開槽中展開完全后，將薄層板從展開槽中取出，通風(fēng)處晾干，在紫外光燈（366nm）下觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)3個(gè)批次供試品薄層色譜圖與黃柏對(duì)照藥材薄層色譜圖在同一位置上有相同顏色的熒光斑點(diǎn)顯現(xiàn)，圖譜顯色清晰，陰性對(duì)照未見干擾。結(jié)果見圖1。
2.1.2補(bǔ)骨脂的薄層鑒別
將樣品研磨成細(xì)粉狀，取2g于具塞錐形瓶中，加入20mL分析純甲醇，超聲波清洗機(jī)超聲45min后過濾取出，在水浴鍋上蒸干得到的濾液，加3mL分析純甲醇溶解殘?jiān)蟮玫降娜芤杭礊楣┰嚻啡芤骸Ａ砣?.5g補(bǔ)骨脂對(duì)照藥材、2g補(bǔ)骨脂陰性樣品分別制備對(duì)照藥材和缺補(bǔ)骨脂的陰性對(duì)照溶液，方法同上[3，5]。參照2020版《中華人民共和國(guó)藥典》四部0502通則[4]下薄層色譜法，將制備好的3個(gè)批次供試品、補(bǔ)骨脂對(duì)照藥材以及缺少補(bǔ)骨脂的陰性對(duì)照溶液各吸取2μL，應(yīng)用薄層色譜點(diǎn)樣儀分別點(diǎn)置于同一個(gè)硅膠G板上，點(diǎn)好的薄層板在內(nèi)含乙酸乙酯-正己烷（3∶1）展開劑的展開槽中展開完全后，將薄層板從展開槽中取出，通風(fēng)處晾干，以10%氫氧化鉀甲醇溶液作為顯色劑，將其均勻的噴灑于展好的薄層板上，105℃恒溫處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)3個(gè)批次供試品色譜圖與補(bǔ)骨脂對(duì)照藥材色譜圖在同一位置上有相同顏色的斑點(diǎn)顯現(xiàn)，圖譜顯色清晰，陰性對(duì)照未見干擾。結(jié)果見圖2。
2.1.3蛇床子的薄層鑒別
將樣品研磨成細(xì)粉狀，取2g于具塞錐形瓶中，加入20mL分析純甲醇，超聲波清洗機(jī)超聲40min后過濾取出，在水浴鍋上蒸干得到的濾液，加3mL分析純甲醇溶解殘?jiān)蟮玫降娜芤杭礊楣┰嚻啡芤骸Ａ砣?g蛇床子對(duì)照藥材、2g蛇床子陰性樣品分別制備對(duì)照藥材和缺蛇床子的陰性對(duì)照溶液，方法同上[3，5]。參照2020版《中華人民共和國(guó)藥典》四部0502通則[4]下薄層色譜法，將制備好的3個(gè)批次供試品、蛇床子對(duì)照藥材以及缺蛇床子的陰性對(duì)照溶液各吸取2μL，應(yīng)用薄層色譜點(diǎn)樣儀分別點(diǎn)置于同一硅膠G薄層板上，點(diǎn)好的薄層板在內(nèi)含二氯甲烷-乙酸乙酯-正己烷（2∶3∶2）展開劑的展開槽中展開完全后，將薄層板從展開槽中取出，避光處晾干，在紫外光燈（366nm）下觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)3個(gè)批次供試品色譜圖與蛇床子對(duì)照藥材色譜圖在同一位置上有相同顏色的熒光斑點(diǎn)顯現(xiàn)，圖譜顯色清晰，陰性對(duì)照未見干擾。結(jié)果見圖3。
2.1.4水紅花子的薄層鑒別
將樣品研磨成細(xì)粉狀，取3g于具塞錐形瓶中，加入20mL分析純甲醇，超聲波清洗機(jī)超聲30min后過濾取出，在水浴鍋上蒸干得到的濾液，加20mL蒸餾水溶解殘?jiān)蟮玫降娜芤河?0mL的乙酸乙酯萃取2次，合并并濃縮乙酸乙酯液，水浴蒸干萃取液，加1mL分析純甲醇溶解殘?jiān)蟮玫降娜芤杭礊楣┰嚻啡芤骸Ａ砣?g水紅花子對(duì)照藥材、3g水紅花子陰性樣品分別制備對(duì)照藥材和缺水紅花子的陰性對(duì)照溶液，方法同上[3，6]。參照2020版《中華人民共和國(guó)藥典》四部0502通則[4]下薄層色譜法，將制備好的3個(gè)批次供試品、水紅花子對(duì)照藥材以及缺水紅花子的陰性對(duì)照溶液各吸取5μL，點(diǎn)于同一張聚酰胺薄膜上，點(diǎn)好的薄膜置于含氯仿-甲醇（3∶2）展開劑的展開槽中展開完全后，將薄膜從展開槽中取出，通風(fēng)處晾干，將10%三氯化鋁乙醇溶液均勻噴在薄膜上，在紫外光燈（366nm）下觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)3個(gè)批次供試品色譜圖與水紅花子對(duì)照藥材色譜圖在同一位置上有相同顏色的熒光斑點(diǎn)顯現(xiàn)，圖譜顯色清晰，陰性對(duì)照未見干擾。結(jié)果見圖4。
2.2含量測(cè)定[7，8]
2.2.1色譜條件
固定相：GeminiC18柱（4.6mm×250mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.1%磷酸溶液（50∶50）（每1000mL加十二烷基苯磺酸鈉0.1g）；流速：1mL/min；柱溫：30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：265nm。
2.2.2對(duì)照品溶液的制備
精密稱取鹽酸小檗堿對(duì)照品適量，加甲醇制成每1mL含0.32mg的溶液，即得。
2.2.3供試品溶液的制備
取裝量差異項(xiàng)下的本品，研細(xì)，取約2g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25mL，稱定重量，超聲處理30min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。
2.2.4陰性樣品溶液的制備
按處方比例分別稱取除黃柏以外的其余藥味，按照加味三核顆粒的制備工藝制成陰性樣品，按2.2.3項(xiàng)下供試品溶液的制備方法制作，制備成陰性樣品溶液。
2.2.5專屬性實(shí)驗(yàn)
分別精密吸取鹽酸小檗堿對(duì)照品溶液，供試品溶液及陰性樣品溶液各10μL，按2.2.1項(xiàng)下所述的色譜條件進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明：陰性樣品溶液在鹽酸小檗堿的色譜峰位置上無(wú)吸收，表明該方法的專屬性良好。結(jié)果見圖5。
2.2.6線性關(guān)系考察
精密稱取鹽酸小檗堿對(duì)照品6.40mg，置10mL棕色量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻；再分別精密吸取0.2、0.4、0.6、0.8、1、1.2、1.6、2mL至2mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，得不同濃度對(duì)照品溶液，分別進(jìn)樣10μL，測(cè)定峰面積積分值，以峰面積積分值為縱坐標(biāo)（Y），進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（X，ng）作圖，得一直線回歸方程：Y＝2883.1X+44363，R2＝0.9996，r＝0.9998，故鹽酸小檗堿進(jìn)樣量在640～6400ng進(jìn)樣范圍內(nèi)，濃度與色譜峰峰面積呈良好線性。
2.2.7精密度實(shí)驗(yàn)
精密吸取鹽酸小檗堿對(duì)照品溶液（0.32mg/mL）10μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定鹽酸小檗堿峰面積積分值，其RSD為0.60%（n=6）。結(jié)果表明：該高效液相色譜儀的精密度良好。
2.2.8穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)
取供試品溶液（批號(hào)20200820）在0、2、4、6、8、10、12h分別進(jìn)樣10μL，測(cè)定樣品中鹽酸小檗堿峰面積積分值，其RSD為0.97%。結(jié)果表明：供試品溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定性良好。
2.2.9重復(fù)性實(shí)驗(yàn)
精密稱取同一批號(hào)（批號(hào)20200820）的加味三核顆粒6份，按3項(xiàng)下供試品溶液的制備方法制備供試品溶液，精密吸取10μL，進(jìn)樣，測(cè)定峰面積積分值并計(jì)算含量。結(jié)果樣品中鹽酸小檗堿的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.9977mg/g，RSD＝1.06%。結(jié)果表明該方法重復(fù)性良好。
2.2.10回收率實(shí)驗(yàn)
精密稱取已知含量批次樣品（批號(hào)20200820，3.9977mg/g）6份，分別精密添加鹽酸小檗堿對(duì)照品適量，按“供試品溶液制備”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，測(cè)定峰面積積分值，計(jì)算回收率。結(jié)果鹽酸小檗堿的平均回收率為100.56%，RSD為1.46%，表明該方法測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確度較高。結(jié)果見表1。
2.2.11樣品含量測(cè)定
取3批樣品，按供試品溶液制備方法制備，依法測(cè)定，計(jì)算樣品中鹽酸小檗堿的含量。結(jié)果見表2。
3討論
本文采用TLC法對(duì)加味三核顆粒中黃柏、補(bǔ)骨脂、蛇床子、水紅花子進(jìn)行定性鑒別，結(jié)果供試品樣品與對(duì)照藥材相對(duì)應(yīng)的位置有相同顏色的斑點(diǎn)，斑點(diǎn)清晰，陰性對(duì)照無(wú)干擾，實(shí)驗(yàn)專屬性強(qiáng)，可以作為加味三核顆粒的定性鑒別方法。黃柏是加味三核顆粒的君藥，其中鹽酸小檗堿為黃柏的主要藥效成分，故選擇鹽酸小檗堿作為控制本品質(zhì)量的指標(biāo)性成分。實(shí)驗(yàn)參照《中華人民共和國(guó)藥典》一部、四部及文獻(xiàn)報(bào)道，采用HPLC法對(duì)鹽酸小檗堿進(jìn)行含量測(cè)定。為獲得最佳的分離效果，依據(jù)參考文獻(xiàn)進(jìn)行條件摸索，最終選擇檢測(cè)波長(zhǎng)為265nm[8]，流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸溶液（50∶50）（每1L流動(dòng)相中加十二烷基苯磺酸鈉0.1g）[4，9]。流動(dòng)相在配置的過程中先配置乙腈-0.1%磷酸溶液，再加十二烷基苯磺酸鈉，這樣操作可以避免大量氣泡的產(chǎn)生。本方法簡(jiǎn)便，容易操作，結(jié)果準(zhǔn)確，可用于加味三核顆粒的質(zhì)量控制。
作者：李慧峰 孟霜 馮振宇 周曉榮 王鑫鑫 裴妙榮 趙建平 單位：山西中醫(yī)藥大學(xué)中藥與食品工程學(xué)院 山西省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室 山西中醫(yī)藥大學(xué)研究生學(xué)院