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作者：郭曉青 吳金鴻 周焱富 王正武 楊科峰 單位：上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院 貴陽護理職業(yè)學(xué)院 福州大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院營養(yǎng)系

1材料與方法

1.1材料與試劑明日葉由上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院種植實驗基地提供。AB-8大孔樹脂、DM130大孔樹脂、HP-20大孔樹脂，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（純度>98%）上海融禾醫(yī)藥科技有限公司，95%乙醇、硝酸鋁、亞硝酸鈉、氫氧化鈉均為分析純。

1.2儀器與設(shè)備RT-25粉碎機北京興時利和科技發(fā)展有限公司；DK-S26電熱恒溫水浴鍋上海精宏實驗設(shè)備有限公司；AG823LC7-NRHE微波爐廣東美的微波爐制造有限公司；離心機Centrifuge5810Reppendorf；DU800uv/visSpectrophotometerBeckmanCoulter，USA；SHA—B雙功能水浴恒溫振蕩器金壇市科析儀器有限公司；DHL-B電腦恒流泵上海青浦滬西儀器廠；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器水浴槽上海青浦滬西儀器廠；FD-1A-50冷凍干燥機北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司。

1.3方法

1.3.1明日葉水溶性總黃酮含量測定

1.3.1.1標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制準(zhǔn)確秤取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品5mg，用95%乙醇溶解，并定量轉(zhuǎn)移至25mL棕色容量瓶中，配成0.20mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。準(zhǔn)確取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.2mg/mL）0.00、0.20、0.40、0.60、1.00、1.20mL，分別置于10mL容量瓶中，加入5%NaNO20.4mL，搖勻，放置6min，再加入10%Al（NO3）30.4mL，搖勻，放置6min，再加入5%NaOH4mL，加水至刻度，搖勻，放置15min，以試劑空白作為參比，在510nm處測定吸光度A，以蘆丁濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[9-10]，得到蘆丁吸光度與濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程y=6.7558x-0.0036R2=0.9942。蘆丁濃度在0—0.024mg/mL范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好線性關(guān)系。

1.3.1.2明日葉水溶性總黃酮含量測定取1mL樣品液，稀釋10倍，再取1mL稀釋液，按標(biāo)準(zhǔn)曲線建立的方法測定吸光度，根據(jù)公式（1）求出樣品液總黃酮含量。

1.3.2明日葉水溶性總黃酮粗提液制備將干燥明日葉粉碎至80目以下。明日葉粉按料液比1：10與去離子水混合，攪拌均勻，采用水浴加熱浸提、直接加熱煮沸浸提、微波輔助浸提三種方法浸提，浸提液冷卻至室溫后8000r/min離心10min，應(yīng)用1.3.1.2測定方法測定上清液總黃酮含量，按公式（2）計算相應(yīng)提取率。比較結(jié)果，選擇最佳浸提方法。

1.3.3.1樹脂的預(yù)處理用95%的乙醇將大孔樹脂浸泡24h，充分膨脹后，用乙醇洗至洗出液加適量的水無白色渾濁，再用去離子水洗去乙醇；然后用5%的HCl溶液浸泡5h，再用去離子水洗至中性；最后用5%NaOH溶液浸泡5h，再用去離子水洗至中性，然后浸泡在去離子水中備用[11]。

1.3.3.2大孔樹脂篩選對AB-8、DM130與HP-20三種大孔樹脂[11-12]，進行靜態(tài)吸附及解吸實驗，比較確定較理想的大孔樹脂。具體實驗步驟如下：分別取2g經(jīng)預(yù)處理的樹脂置于錐形瓶中，加入加入質(zhì)量濃度為1.557mg/mL樣液50mL，置于18℃水浴恒溫震蕩器上震蕩12h，充分吸附后將樣液靜置10min，按1.3.1.2測定上清液中的水溶性總黃酮濃度，再根據(jù)公式（3）與公式（4）分別計算總黃酮吸附量和吸附率。將上述吸附飽和的大孔樹脂用蒸餾水洗至洗脫液無色，濾紙吸干樹脂表面殘留溶液，加入95%乙醇50mL，置35℃水浴恒溫震蕩器震蕩12h，充分解吸后將樣液靜置10min，測定洗脫液中總黃酮濃度，根據(jù)公式（5）計算解析率。

1.3.3.3大孔樹脂提純工藝的優(yōu)化用濕法將10mL樹脂裝入層析柱（1.6cm×20cm）中，取質(zhì)量濃度為2.445g/mL的一定體積的明日葉水溶性總黃酮粗提液，以1mL/min流速上樣，每1BV收集一份流出液，測定每份流出液中總黃酮含量，繪制泄露曲線，確定最佳上樣量。以最佳上樣量上樣，測定洗脫液最佳pH值、最佳洗脫濃度以及最佳洗脫用量。

1.3.4明日葉水溶性總黃酮提純產(chǎn)物分析在最佳的提純工藝條件下，收集大孔樹脂洗脫液，將其旋轉(zhuǎn)蒸餾濃縮，冷凍干燥，得到提純產(chǎn)物。測定提純產(chǎn)物樣品中紫外吸收光譜（波長測定范圍：200-510nm）、總黃酮含量、總糖含量[13]，并分析測定其特征性顯色反應(yīng)[14]以初步判斷其所含的黃酮類別。

1.3.5數(shù)據(jù)處理實驗數(shù)據(jù)以三個獨立重復(fù)實驗的平均值表示，實驗結(jié)果采用t檢驗進行統(tǒng)計分析，p<0.05時具有顯著性差異，p<0.01時具有極顯著性差異。

2結(jié)果與分析

2.1明日葉水溶性總黃酮的浸提方法

2.1.1水浴加熱浸提對明日葉水溶性總黃酮提取率的影響在不同的浸提溫度和浸提時間的條件下水浴加熱浸提得到的粗提液水溶性總黃酮提取率分析結(jié)果分別見圖2和圖3。由圖2可知，水浴加熱浸提10min，隨著溫度升高浸提液中水溶性總黃酮提取率升高，溫度達到75℃,總黃酮提取率顯著增加（p<0.05）,95℃時總黃酮提取率達到最大值，為2.52%。由圖3可知，在水浴95℃條件下浸提，隨著加熱時間增加，總黃酮提取率先增加，浸提10min時浸提液總黃酮提取率達到最大值(p<0.05)，隨后總黃酮提取率逐漸降低。因此，水浴加熱浸提的最佳條件是95℃水浴加熱10min。

2.1.2加熱煮沸浸提對明日葉水溶性總黃酮提取率的影響由圖4可知，隨著煮沸浸提時間增加，總黃酮含量先增加，沸騰狀態(tài)下浸提5min時浸提液總黃酮含量顯著增加（p<0.05），隨后增加趨緩，5min—10min（p>0.05）,浸提10min后總黃酮含量顯著降低(p<0.05)。因此，直接加熱煮沸最佳浸提時間是5min。由結(jié)果可以看出，95℃水浴加熱10min浸提提取率最大。同時，兩種方法浸提10min后浸提液中總黃酮提取率反而降低。這是因為黃酮苷元本身難溶于水或不溶于水，但當(dāng)引入羥基或糖苷變成黃酮苷類物質(zhì)后后極性增大，在水中溶解度增加[14]。明日葉中含有較多的水溶性黃酮糖苷類物質(zhì)，但在較高加熱溫度下，加熱時間過長時容易使黃酮糖苷類發(fā)生了水解，轉(zhuǎn)化為黃酮苷元，從而降低了在水中的溶解度，導(dǎo)致水溶性黃酮含量減少。同時黃酮苷類的水解情況根據(jù)糖的種類和鏈接在糖的母核上的位置不同而不同，有的水解只需幾分鐘，而有的則需幾小時[14]，這也是不同浸提時間增加，水溶性黃酮提取率不同的主要原因。

2.1.3微波輔助浸提對明日葉水溶性總黃酮提取率的影響據(jù)有關(guān)文獻報道，加熱浸提后再進行微波輔助提取，黃酮提取率會大幅度增加[15]。95℃水浴加熱10mim后，進行微波輔助浸提，實驗結(jié)果見圖5。由圖5可知，95℃水浴加熱10mim后，再進行微波輔助提取，總黃酮提取率沒有明顯增加（p>0.05），而且助提3次后總黃酮含量還明顯降低了（p<0.05）。綜合以上實驗結(jié)果，結(jié)合經(jīng)濟效益與提取率等因素，本文確定最適的浸提方法為水浴加熱浸提，最佳浸提條件為浸提溫度為95℃，浸提時間為10min。#p#分頁標(biāo)題#e#

2.2明日葉干粉水溶性總黃酮測定

稱取5克明日葉（去除根莖）粉末放入燒杯中，加入50mL去離子水，攪拌混合均勻，將燒杯置于水浴鍋中，然后在95℃的浸提溫度下攪拌水浴浸提10min，冷卻至室溫，在8000r/min離心10min，取離心上清液。再將沉淀洗滌三次，同樣條件離心，合并上清液，測定總黃酮含量，得出明日葉總黃酮含量為3.74%。

2.3大孔樹脂提純化明日葉水溶性總黃酮的工藝

2.3.1樹脂篩選選取文獻[16-18]中對分離黃酮類化合物作用較好的3種大孔樹脂(DM130、HP-20、AB-8)按1.3.2.2方法，對明日葉水溶性總黃酮粗提液進行靜態(tài)吸附及解吸實驗，實驗結(jié)果見表1。從表1可知，與其他兩種樹脂比較，HP-20大孔樹脂對明日葉水溶性總黃酮的吸附量和吸附率都最高，吸附量達31.30mg/g，吸附率達到80%，解吸率也最大，達到32%，因此選擇HP-20大孔樹脂對明日葉水溶性總黃酮進行提純。

2.3.2最佳上樣量確定由圖6可知，第1個和第2個BV泄露較少，第3個BV開始泄露較多一點，但此時樹脂吸附較少，第4個柱體積后樣液泄露明顯增加，且含量超過5mg。因此綜合泄露情況和樹脂吸附情況，確定當(dāng)粗提液濃度為2.445mg/mL時，最佳上樣量為4個BV（即40mL）比較合適。

2.3.3洗脫液pH測定最佳上樣量（4BV）上樣，用100mL80%乙醇洗脫，調(diào)節(jié)洗脫液pH值，測定在pH值分別為2、3、4、5、6時洗脫液中總黃酮含量，測定結(jié)果見圖7。由圖7可知，隨著pH值的降低，洗脫液中總黃酮含量明顯提高，當(dāng)pH值為3時，洗脫液總黃酮回收率急劇增加（p<0.01），當(dāng)pH值為2時達到最大值59.9。但如果pH值再降低，即洗脫液酸性過強，可能會對黃酮苷類物質(zhì)性質(zhì)產(chǎn)生影響，如發(fā)生酸水解等。因此洗脫液最適pH值為2。

2.3.4洗脫液濃度測定最佳上樣量上樣，用100mL乙醇洗脫，pH值調(diào)至2，調(diào)節(jié)乙醇濃度，測定不同乙醇濃度的洗脫液中總黃酮含量，結(jié)果見圖8。由圖8可知，洗脫液乙醇濃度達到70%時洗脫液總黃酮含量最大，洗脫液總黃酮回收率為61.85%（p<0.05）。所以確定乙醇洗脫液適宜濃度為70%。

2.3.5洗脫液用量測定最佳上樣量上樣，用70%乙醇（pH調(diào)至2）洗脫，1BV收集一份，測出每份洗脫液中總黃酮含量，測定結(jié)果見圖9。由圖9可知，第一份柱體積總黃酮含量最大，然后逐漸降低，第8份洗脫液已經(jīng)幾乎不含有總黃酮含量，所以最佳洗脫用量為8BV。

2.3.6最佳提純工藝條件綜上所述，應(yīng)用HP-20大孔樹脂對明日葉水溶性總黃酮進行動態(tài)的提純，其最佳提純工藝條件為：質(zhì)量濃度為2.445mg/mL樣液最適上樣量為4BV，乙醇洗脫液最適pH值為2，適宜濃度為70%，最佳洗脫用量為8BV。

2.4明日葉水溶性總黃酮提純產(chǎn)物分析

在最佳提純工藝條件制備明日葉水溶性總黃酮提純產(chǎn)物，即：取2.445mg/mL樣液40mL（4BV），總黃酮含量97.8mg。以2mL/min上樣，用60mL（6BV）水洗滌，再用80mL（8BV）70%乙醇（pH調(diào)至2）洗脫，測定洗脫液總黃酮含量。重復(fù)三次取平均值，測得洗脫液總黃酮含量為60.76mg，回收率達到62%。將洗脫液旋轉(zhuǎn)蒸餾，冷凍干燥，得到明日葉水溶性總黃酮提純產(chǎn)物，按1.3.1.2方法測定其所含總黃酮含量，計算得到提純后的樣品中含量為29.2%，比明日葉干粉的含量提高了約6.8倍。提純產(chǎn)物進行了紫外-可見波長掃描，結(jié)果圖10。從結(jié)果可見，提純產(chǎn)物在200-350nm范圍有黃酮類物質(zhì)特征性兩個吸收帶，在200-280nm區(qū)域吸收帶與黃酮物質(zhì)中苯甲酰生色團有關(guān)，在300-400nm區(qū)域吸收帶與肉桂酰生色團有關(guān)。應(yīng)用苯酚-硫酸法測定總糖，粗提物中總糖含量15.57%，而提純產(chǎn)物中總糖相對含量提高到35.57%。結(jié)果說明提純產(chǎn)物中的黃酮苷類可能含黃酮糖苷。對提純產(chǎn)物與三氯化鋁、三氯化鐵、醋酸鉛試劑進行顯色反應(yīng)，顯色結(jié)果見表2。根據(jù)表2顯色結(jié)果推斷提純產(chǎn)物中黃酮類物質(zhì)可能的結(jié)構(gòu)表明，提純產(chǎn)物所含有的黃酮類物質(zhì)可能含有酚羥基、鄰二酚羥基或3-OH、4-酮基，5-OH、4-酮基等結(jié)構(gòu)[14]。

3結(jié)論

3.1本文對水浴加熱浸提、直接加熱煮沸浸提、微波輔助提取三種方法進行試驗，確定明日葉水溶性總黃酮提取最佳方法是水浴加熱浸提，最佳浸提條件為水浴溫度95℃，加熱時間10min。

3.2本文利用大孔樹脂對明日葉水溶性總黃酮粗提液進行提純。通過靜態(tài)吸附-解吸實驗，結(jié)果表明，HP-20大孔樹脂對明日葉水溶性總黃酮具體良好的提純效果；動態(tài)實驗下，其最佳的提純工藝條件為：上樣量為4BV，乙醇洗脫液濃度為70%，pH值為2，洗脫用量為8BV。

3.3在最佳的提純工藝條件下制備的產(chǎn)物中黃酮的含量由明日葉干粉的3.74%總黃酮含量提高到29.2%，提高了7.81倍，說明提純效果很好。提純產(chǎn)物在200-400nm范圍有黃酮類物質(zhì)特征性兩個吸收帶，總糖含量由粗提物的15.57%總糖含量提高到35.57%，同時與三氯化鋁、三氯化鐵、醋酸鉛試劑進行顯色反應(yīng)分別顯示黃色、藍黑色和黃色沉淀，說明提純產(chǎn)物可能含有酚羥基、鄰二酚羥基或3-OH、4-酮基，5-OH、4-酮基等結(jié)構(gòu)特點的黃酮糖苷類物質(zhì)。